SFC纯化的基础是超临界流体技术(SFx)。沃特世SFx技术包括超临界流体萃取(SFE)、分析型色谱(UPC²)和制备型色谱(Prep SFC)，它们都以亚临界或超临界状态的CO₂为主要溶剂。SFx技术采用CO₂替代液态有机溶剂和水性溶剂，是液相纯化技术的正交技术，而且更加环保和经济有效。之所以说SFx是一项“绿色”技术，是因为它不产生有机废液，可减少环境影响。相较于LC纯化，SFx在速度和选择性方面均有显著提升，这意味着从复杂原料到终产物所需的时间和成本大大降低。随着仪器技术的发展，各种纯化应用越来越明显地体现出SFx技术带来的分离能力优势。

很多物质在极端条件下才能转变为超临界状态，而且在该状态下会表现出某些不良特性。表1所示为几种物质转变为超临界流体的条件及其在此状态下的特性。不同于其他超临界物质，CO₂不可燃、无爆炸危险、无毒性或腐蚀性，因此通常被认为是一种十分安全的物质。此外，CO₂很容易达到超临界状态（在31 °C和74 bar下），因此人们能够在可接受的温度和压力范围内控制其密度。不仅如此，由于临界温度相对温和，它还适用于处理热不稳定样品。CO₂还易于通过其他工业工艺回收，因而价格相对低廉；这意味着它对环境CO₂水平的影响是中性影响。上述所有优势使得CO₂成为了超临界流体技术最常用的物质。

纯化工作流程由多个步骤组成，其复杂性和必要性根据应用要求而异。最基本的SFx纯化工作流程包括以下方面：

原料或样品：样品可能很复杂（例如天然的植物性样品），也可能相对简单（例如经过准确表征的候选药物），这将决定需要进行何种程度的样品制备（如果需要）以及纯化的规模。尽可能收集有关样品和最终产品的信息（例如热稳定性、极性、溶解度和反应性）也很重要，这些信息将决定样品的处理方式。

样品制备：纯化的第一步需要根据原料状态和应用的目的或适用范围正确地制备样品。样品制备可能包括研磨、干燥、提取和过滤等多个步骤，也可能只需溶解样品将其制成溶液。超临界流体萃取(SFE)是SFx工作流程的第一步（即样品制备）。该技术通常用于涉及工业粗制品、植物性材料或天然产物的应用。

样品纯化：纯化的作用是降低样品复杂性，或者分离出纯度达到指定范围的终产物进行分析或用于产品配方。通过SFE制备的样品通常是含有目标化合物和杂质的复杂混合物。作为SFx工作流程的第二个步骤（纯化），制备型超临界流体色谱(Prep SFC)会从提取物中纯化出一种或多种目标物质。Prep SFC还可应用于多种其他方法制备的样品，而不仅仅局限于SFE法制备的样品。

终产物：获得终产物是工作流程的最终目标。它可以是分析得到的数据和信息、某种工艺所需的精炼原料，或者是可直接使用的终产物。终产物决定了成功的工作流程所需的仪器和方法。在SFx工作流程中，提取(SFE)和纯化(Prep SFC)之前及之后的样品分析由超高效合相色谱(UPC²)完成。

上述SFx技术中的任何一种都可以根据需要用于非SFx工作流程中的样品制备、纯化或分析步骤。

过去20年来，制备型高效液相色谱(Prep HPLC)一直都是较常用的纯化技术之一。具体而言，该技术是精细化学品、制药和生物技术行业普遍使用的一种分离工艺，广泛应用于产品纯化。在这期间，Prep HPLC已发展成为一种非常高效且适用性极广的技术，尤其是在非手性纯化领域。反相液相色谱(RPLC)的优势是采用几乎通用的固定相(C₁₈)，以及由水和乙腈组成的通用混合流动相。RPLC兼容质谱(MS)分析，它与MS联用(RPLC-MS)已成为许多研究环境下的标准纯化方法。

尽管应用广泛，Prep HPLC也存在诸多缺点。相较于处理的总样品量，纯化一定质量化合物的流动相用量相当大。典型的Prep HPLC馏分含有大量溶剂（包括有机溶剂和水性溶剂），分析人员需要花费大量时间和精力来干燥和获取终产物，这极大限制了纯化效率。

LC所用的溶剂会污染局部环境（通过蒸发或接触）和大气环境（通过化学废弃物焚烧）。正相液相色谱(NPLC)对环境的危害更大，因为其流动相通常是纯有机溶剂。鉴于上述环境问题，购买和处置LC流动相溶剂的成本越来越高；因此人们迫切需要一种对溶剂依赖程度更低或更环保的纯化方法。SFC正是这样一种替代方案，它有助于突破效率瓶颈，同时可带来缩短用时、减少废液和降低成本等好处。最近，SFC仪器方面的进展使得该技术作为手性和非手性纯化的一种有用工具再次成为人们的关注焦点。在分析和纯化领域，SFC是比HPLC更加环保的一种替代方法。

超临界流体色谱(SFC)是一种色谱技术，其使用亚临界（液态）和超临界CO₂作为流动相的主要溶剂，通常还需搭配有机溶剂使用。和所有色谱技术一样，SFC技术也基于分析物在固定相（色谱柱）和流动相（溶剂）之间的分配来分离各组分。HPLC与SFC有许多相似之处，例如：SFC可在等度和梯度方法条件下运行，并且兼容所有标准检测技术，如紫外(UV)检测、光电二极管阵列(PDA)检测、蒸发光散射(ELS)检测和质谱(MS)检测。常规Prep SFC工作流程与HPLC的相同，包括方法开发、放大、馏分收集，以及对收集到的馏分进行纯度分析（图3）。SFC的回收率和样品纯度可媲美RPLC，在某些应用中SFC的回收率较高，而对于其他应用，HPLC是更好的解决方案。

SFC一般采用正相色谱分离原理。SFC与HPLC的不同之处在于，SFC采用CO₂替代非极性液态组分（例如正己烷和庚烷）作为流动相的主要组分。由于超临界CO₂是可压缩流体，因此压力和温度是控制溶剂强度，进而影响色谱保留时间和选择性的重要参数。超临界CO₂是色谱纯化的理想之选，因为其不可燃、无毒并且具有高扩散性、低粘度和出色的溶解能力。近年来，得益于节省溶剂和高效率的优势，SFC备受纯化实验室青睐。

由于采用CO₂替代了大部分流动相，Prep SFC的主要优势之一是溶剂用量少。这一优势在分析级分离中也许并不明显，但在制备级分离中效果相当显著。许多纯化实验室都需要花费相当多的时间从馏分中去除溶剂，这极大制约了化合物纯化完成后获得目标产物或结果的效率。在Prep SFC中，流动相中的CO₂通过降压即可除去，只剩下少量助溶剂。所得馏分中的产物浓度也更高，缩短了去除溶剂和产物分离所需的时间。馏分还可以直接用于分析，无需进行样品富集或浓缩。对于那些在普通长时间干燥条件下会发生降解的化合物而言，这一点至关重要。

SFC有机溶剂用量较低带来的其他优势还包括节约成本、更安全（就可燃性和毒性角度而言），以及对环境影响更小等等。在溶剂购买和处置方面，SFC的成本优势相当可观；除此之外，由于去除溶剂所需的能耗更低，还能进一步节省成本。SFC还可避免使用有毒溶剂，例如RPLC使用的乙腈以及NPLC使用的脂肪烃和氯化物溶剂。作为其他工业工艺的副产物，CO₂价格相对低廉，而且可以循环使用。

Prep SFC优势：提高工作效率

SFC效率的提升得益于流动相的低粘度和高扩散性对色谱分析速度和效率的提升。图4比较了HPLC、UPLC、SFC和UPC²的Van Deemter曲线。在色谱分析中，分离速度部分取决于溶质在流动相中的扩散速度及其进出固定相的速度。SFC的Van Deemter曲线比HPLC更宽更平，这表示SFC在流速（线性流速）增大的情况下仍能保持较高的色谱效率（低塔板高度）。SFC的高扩散系数直接转化成了更快的色谱分析速度。

由于流动相粘度较低，色谱柱和系统压力也较低，因此可采用高达HPLC流速3~4倍的线性流速以及粒径更小的色谱柱。此外，低粘度还能缩短平衡时间。这样一来，运行时间缩短，分离效率提高，进而可增大载样量并缩短进样周期；这些对于任何制备型色谱分离而言都是提高效率的关键参数。因此，SFC得以在更短的时间内获得纯化合物，从而提高总体工作效率。表2给出了SFC相较于HPLC更省时、更高效的示例。

利用SFC与RPLC的正交关系可提高多种应用的产物质量。采用C₁₈色谱柱的RPLC是一种几乎通用的解决方案，能够极大简化方法开发过程，但由于其使用水性流动相，溶剂兼容性和化合物溶解性非常有限。另一方面，SFC可配合多种有机稀释剂使用，对溶剂和化合物的兼容范围更广。此外，SFC可选用的固定相也非常丰富。

之所以说SFC是RPLC的正交检测技术，是因为SFC一般被视为正相色谱，并且可提供多种易于操作的色谱分离选项。由于兼具正相选择性和高分离效率，SFC在立体异构体、位置异构体和结构相似化合物分离方面的优势尤其明显。对于非极性化合物，SFC的灵活性允许分析人员采用反相色谱柱（例如C₁₈），同时以水作为添加剂，将应用扩大到极性更强的范围。对于化合物易降解的应用，SFC纯化更是理想的替代解决方案，因为SFC方法分离速度快、不使用水，并且馏分干燥步骤能在低温条件下快速完成。

Prep SFC的回收率和纯度可媲美RPLC，某些应用采用SFC和RPLC均可。一项研究筛查了SFC和LC纯化对某制药化合物数据库中化合物的适用性，所得结果如图5所示。约82%的化合物可通过两种纯化技术中的任意一种进行纯化。但除此之外，该研究还证明了这两种纯化平台的互补性。部分化合物只能通过SFC法纯化(4%)，还有一部分化合物只能通过LC法纯化(8%)。两种纯化平台联用所带来的灵活性为优化分离和纯化方案提供了更多可能性。SFC的选择性与RPLC互补，因此我们可在方法开发过程中引入正交技术用于分离复杂的棘手样品。采用跨平台多步纯化方案或使用正交技术进行馏分分析，可获取纯度更高的产物和更丰富的信息。图6所示为采用正交的LC和SFC分离方法纯化某复杂基质中所含化合物的示例。