SPE初学者指南

SPE是色谱方法

请记住，固相萃取与HPLC具有相同的基础。任何关于目标分析物及其他基质组分的色谱行为知识，对于选择合适的吸附剂和洗脱液都有帮助。例如，如果您知道某些色谱条件能够很好地分离分析物与干扰物质，那么可以选择类似条件的SPE吸附剂和溶剂组合。类似地，如果您试图在HPLC中去除共洗脱的干扰物，那么您就会基于先验知识，知道类似的SPE条件无法成功分离。

常规洗脱方案

分离和净化目标样品组分的常规策略有两种：

• 吸附基质干扰物，而目标组分无保留地通过小柱。
• 吸附目标组分，而基质干扰物无保留地通过小柱。

当所需的样品组分浓度高时，通常选择第一种策略。当目标组分浓度低时，或者需要分离极性差异很大的多种组分时，通常采用第二种策略。采用第二种策略也能够实现极低含量化合物的痕量浓缩以及稀释样品的浓缩。

固相萃取程序的步骤

以下小节介绍了完整的固相萃取程序所涉及的步骤。在许多应用中，可以省略下面列出的一个或多个步骤，从而简化固相萃取程序，这些步骤说明请参见后面的常规示例。本文所示的固相萃取程序使用包含染料的样品，以便能够轻松观察到分离。请记住，大多数包含无色组分的样品需要某种类型的检测器或测试，才能在收集的馏分中找到这些组分。在您开发自己的萃取程序或修改文献中发表的萃取程序时，请使用以下信息作为指导。

1. 样品预处理
2. 小柱活化
3. 上样
4. 馏分洗脱

正相色谱

这种模式是中性有机化合物（化学性质从疏水到中等极性）的经典应用模式。

要使用SPE小柱进行正相色谱分析，请使用非极性溶剂的步长梯度和极性填料。

1. 使用6-10倍保留体积的非极性溶剂（通常与溶解样品的溶剂相同）对小柱进行活化。
2. 将样品溶液上样到柱床上。
3. 使用非极性溶剂洗脱不需要的组分。
4. 使用极性更强的溶剂洗脱第一种目标组分。
5. 使用极性逐渐增加[更强]的溶剂洗脱剩余的目标组分。
6. 当完成所有组分的回收时，请安全妥善地丢弃用过的小柱。

下图展示了该程序，其中样品包含三种中性、相对非极性的有机染料[黄色、红色和蓝色]混合物，该混合物最初上样到柱床上时呈黑色。

利用SPE小柱
（硅胶、Florisil、氧化铝、二醇、CN、NH₂）进行正相色谱分离的常规洗脱方案图示

反相色谱

由于水性样品种类繁多，其应用涵盖了从环境水样到水果和蔬菜、从饮料到生物液体，因此反相色谱已成为SPE的主要模式。

要使用SPE小柱进行反相色谱分离，请使用极性从强到弱（溶剂洗脱强度从弱到强）的梯度和非极性填料。

1. 使用6-10倍保留体积的甲醇或乙腈溶解硅胶键合相或聚合物填料。使用6-10倍保留体积的水或缓冲液冲洗小柱。请勿使小柱变干[除非使用HLB]。
2. 上样溶解于强极性[弱]溶剂[通常是水]的样品。
3. 使用强极性溶剂洗脱不需要的组分。
4. 使用极性较小的溶剂洗脱弱保留的目标组分。
5. 使用非极性越来越高[更强]的溶剂洗脱结合更紧密的组分。
6. 当完成所有目标组分的回收时，请安全妥善地丢弃用过的小柱。

下图展示了该程序，其中样品为包含两种极性食品染料[红色和蓝色]以及糖和人造调味剂[但不含真正的葡萄汁！]的葡萄味饮料。制备后的该饮料在玻璃杯中呈淡紫色，因为染料浓度很稀。当一部分样品上样到准备好的SPE小柱上时，强保留性色素在入口附近浓缩，形成深紫色条带。

利用SPE小柱（C₁₈、tC₁₈、C₈、CN、二醇、HLB、Porapak RDX、NH₂）进行反相色谱分离的常规洗脱方案图示

离子交换色谱

离子型或可电离化合物一般最好使用某种形式的离子交换色谱法进行分离。这种分离模式与更广泛使用的正相和反相模式具有正交性，可为样品制备方案提供强大、选择性的第二维度。

两种主要类型的固定相（阴离子交换和阳离子交换）
以及它们如何选择性地吸引和保留带相反电荷分子的图示

要使用SPE小柱进行离子交换色谱分离，请使用pH或离子强度梯度和离子交换填料。

1. 使用6-10倍保留体积的去离子水或弱缓冲液活化小柱。
2. 上样溶解于去离子水或缓冲液的样品。
3. 使用弱缓冲液洗脱不需要的弱结合组分。
4. 使用更强一些的缓冲液洗脱第一种目标组分（改变pH或离子强度）。
5. 使用逐渐增强的缓冲液洗脱其他组分。
6. 当完成所有组分的回收时，请妥善地丢弃用过的小柱。

下图展示了该程序，其中样品是两种具有不同pK_a值的离子染料的水性混合物。当上样到小柱时，两种染料均得到（强）保留，蓝色和黄色组分的组合在入口附近显示为绿色条带。

利用SPE小柱（NH₂、Accell™ Plus QMA、Accell Plus CM、SCX、SAX、WCX、WAX）进行离子交换色谱分离的常规洗脱方案图示

阳离子交换剂和阴离子交换剂可进一步分为弱交换剂或强交换剂，具体取决于其表面离子基团的类型。强阳离子交换剂具有酸性表面基团，例如在整个pH范围内始终会离子化[带负电荷]的磺酸。弱阳离子交换剂具有酸性表面基团，例如在高pH时带负电荷但在低pH时呈中性的羧酸。类似地，强阴离子交换剂通常具有始终带正电荷的季铵基团，而弱阴离子交换剂具有伯胺、仲胺或叔胺基团，它们在低pH时可能带正电荷，但在高pH时呈中性。

使用下表作为指南，针对您的特定分析物选择合适的SPE离子交换小柱类型。

混合模式离子交换色谱可在单个SPE小柱上将反相和离子交换模式结合到单一方案中，可用于从单一复杂基质中分离中性、酸性和碱性化合物。理想的混合模式SPE吸附剂底物应保持水可浸润性，同时对疏水性化合物表现出强反相保留性。吸附剂表面具有上述四种一般类型离子交换功能的其中之一。使用适当洗脱强度的有机溶剂混合物进行中间洗涤，可进行中性化合物分离[包括处于中性状态的可电离分析物]。离子结合分析物的选择性洗脱可通过控制分析物[当与强离子交换剂结合时]或吸附剂[当分析物与弱离子交换剂结合时]的电荷来实现。