Praktische Ansätze zur Peptidtrennung

Säulenauswahl

Im Idealfall wird durch die Verwendung einer einzigen Säulenchemie für alle Proben, einschließlich gewöhnlicher Peptide (mit einer Mischung aus sauren, basischen und unpolaren Resten), basischer Peptide, großer Peptide (30 – 40 Reste) und hydrophober Peptide, der Säulenbestand reduziert und die Notwendigkeit, mehrere Säulen für jede Rohprobe zu screenen, entfällt. Während C₁₈-Phasen in der Regel für viele Peptidtrennungen verwendet werden, ist das Basispartikel, an das C₁₈ gebunden ist, auch ein kritischer Faktor, der die chromatographische Retention, Auflösung und Peakform beeinflusst. XBridge Peptide BEH Säulen basieren eher auf Hybridpartikeln mit Ethylenbrücken als auf reinem Silika. Das BEH-Partikel (Bridged Ethylsiloxan/Silika-Hybrid) (Abbildung 7) minimiert sekundäre Wechselwirkungen mit Peptiden und ist sowohl bei hohem als auch bei niedrigem pH-Wert stabil, um maximale Flexibilität bei der Entwicklung von Trennungen zu gewährleisten. Das synthetische Packungsmaterial ist mit 130 oder 300 Å Poren in den Partikelgrößen 3,5, 5 und 10 µm erhältlich. Für atypische Proben oder extrem hydrophobe Peptide ist dasselbe Basispartikel mit C_8- oder C₄-gebundenen Phasen verfügbar.

Die ungefähren Massenladekapazitäten für Peptide bei verschiedenen Säulendimensionen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1. Ungefähre Massenbeladbarkeit der Peptide für die Umkehrphase

*5 µm und 10 µm OBD Präparative Säulen; ** 10 µm OBD Präparative Säulen

Viele Faktoren wirken sich auf die Massenbeladbarkeit präparativer Säulen aus. Die aufgeführten Kapazitäten stellen eine „durchschnittliche“ Schätzung mit angemessenen Flussraten und Injektionsvolumina für jede Dimension dar. Folgende Faktoren sind in Betracht zu ziehen:
1) Die Kapazität für Peptide hängt hauptsächlich von der Löslichkeit der jeweiligen Probe ab.
2) Die Kapazität ist geringer, wenn eine höhere Auflösung erforderlich ist.
3) Die Kapazität hängt von den Beladungsbedingungen ab, jedoch weniger als bei kleinen Molekülen.
a) Peptide werden normalerweise unter stark wässrigen Bedingungen geladen, oft unter Zusatz von TFA. Die Volumenbeladbarkeit ist unter diesen Bedingungen praktisch unbegrenzt. Die Kapazität wird durch die Löslichkeit während der Elution begrenzt.
b) Getrocknete Peptide können mit Lösungsmitteln wie DMF oder DMSO befeuchtet werden. Sie werden dann oft wie oben mit Wasser, das TFA enthält, verdünnt.
c) In einigen Fällen werden Peptide in DMF oder DMSO gelöst und in diese Lösung injiziert. Für diese Bedingung gelten die Mengenrichtlinien in der Tabelle.
4) Angemessene Injektionsvolumina basieren auf einem Säulendurchmesser bei einer Länge von 50 mm mit relativ starken Lösungsmitteln. Eine größere Länge ist mit einem größeren Injektionsvolumen kompatibel, aber nicht proportional. Schwache Lösungsmittel erhöhen das Injektionsvolumen erheblich.
5) Angemessene Flussraten basieren auf dem Säulendurchmesser. Die Systeme werden dadurch eingeschränkt, dass der Rückdruck mit zunehmender Länge und abnehmender Partikelgröße steigt. Manche Anwender ziehen es vor, Peptide langsamer laufen zu lassen als kleine Moleküle, und verwenden daher die Hälfte der empfohlenen Flussrate, aber mit der doppelten Gradientendauer.

Die Eignung der XBridge Peptide BEH C₁₈ 130 Å als Säule der Wahl für Standardpeptidtrennungen wurde durch die Ergebnisse nach dem Testen eines Panels von vier Peptiden mit unterschiedlichen Eigenschaften definiert. Die Peptidsequenzen sind proprietär, aber die wichtigsten Eigenschaften der einzelnen Peptide sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2. Eigenschaften des Peptidtestpanels

Peptide sind aufgrund des Vorhandenseins von sowohl schwach sauren (Carbonsäure) als auch schwach basischen (Amino) funktionellen Gruppen amphiprotisch. Da Peptide sowohl positive als auch negative Ladungen haben, werden sie Zwitterionen genannt. Wenn ein Peptid, das in einer Lösung mit einer spezifischen Wasserstoffionenkonzentration gelöst ist, einem elektrischen Feld ausgesetzt wird und es nicht wandert, ist diese Wasserstoffionenkonzentration der isoelektrische Punkt (pI) des Peptids. Der isoelektrische Punkt (pI) ist daher vereinfacht der pH-Wert, bei dem das Peptid eine Nettoladung von null hat.

Wie von Browne, Bennet und Solomon beschrieben, sagt der HPLC-Index den prozentualen Anteil an Acetonitril voraus, der zur Elution des Peptids von einer C₁₈-µBondapak-Säule mit TFA:Wasser:Acetonitril als Puffersystem erforderlich ist. Sie isolierten Peptide aus biologischen Verbindungen und sagten das Elutionsprofil auf Basis der Aminosäurezusammensetzung voraus. Hohe HPLC-Indexwerte weisen daher auf eine erhöhte Hydrophobizität auf einer C₁₈-Säule hin. Die Werte ändern sich natürlich je nach Säule und mobiler Phase, aber dieses einfache System liefert einige voraussagbare Informationen über die Art der Peptide.

Die Chromatographieprofile der vier Peptide im Testpanel unter sehr häufigen Bedingungen – 0,1 % Ameisensäure in Wasser und in Acetonitril mit einem Gradienten von 5 – 50 % B in 50 Minuten sind in Abbildung 8 dargestellt. Alle vier Modellpeptide zeigen eine vollkommen akzeptable Chromatographie mit scharfen, symmetrischen Peaks.

Es ist wichtig, zu überlegen, ob es eine chromatographische Verbesserung für die großen oder hydrophoben Peptide gibt, wenn eine Säule mit einer Porengröße von 300 Å verwendet wird. Das größte Peptid im Peptidtestpanel zeigt mit 39 Resten und einem Molekulargewicht über 4000 Da nur eine geringe Verbesserung der Peakform mit dem Packungsmaterial mit größerer Porengröße (Abbildung 9). Das Peptid eluiert etwas früher, wobei der Unterschied etwa 1 – 2 % Acetonitril entspricht. Bei der Verwendung von Packungsmaterial mit einer Porengröße von 130 Å gibt es eine Größenbeschränkung. Sie liegt höchstwahrscheinlich über etwa 40 Resten.

Das hydrophobe Peptid mit einem HPLC-Index von 113 eluiert ebenfalls als scharfer, symmetrischer Peak sowohl auf der 130-Å- als auch der 300-Å-Packung (Abbildung 10). Die Peptidkonformation, also die Art und Weise, wie das Peptid in der Lösung gefaltet wird, kann ebenfalls die beste Wahl der Porengröße für eine bestimmte Trennung beeinflussen. Ebenso wie es keine festen Regeln für die Beladbarkeit von Peptiden gibt, so spielen auch individuelle Peptideigenschaften bei der Entscheidung über die beste zu verwendende Porengröße eine Rolle. Aus den oben besprochenen Experimenten kann geschlossen werden, dass die XBridge Peptide BEH-Säulen mit C₁₈-gebundener Phase und 130 Å Poren eine gute Wahl als Ausgangspunkt für die Peptidtrennung ist.

Vom Standpunkt der Wirtschaftlichkeit und Effizienz bei der Durchführung der Peptidtrennung im großen Maßstab ist es wichtig, die Partikelgröße zu berücksichtigen. Das Basispeptid, das auf drei Säulen mit unterschiedlichen Partikelgrößen gemessen wurde, veranschaulicht die Konsistenz der Trennung (Abbildung 11). Obwohl die Peaks mit der größeren Partikelgröße breiter und weniger gut aufgelöst sind, ist die chemische Selektivität bei skalierbaren BEH-Säulenpackungen gleich, ob die Partikelgröße 3,5, 5 oder 10 µm beträgt. Trennungen im großen Maßstab profitieren von der größeren Partikelgröße, die schnellere Flussraten auf Säulen mit immer größerem Durchmesser und handhabbaren Druckgrenzen ermöglicht. All dies verbessert die Beladbarkeit, verringert die Anzahl der chromatographischen Läufe und spart Zeit und Ressourcen.

Obwohl Peptide einzigartige Eigenschaften haben, die den Erfolg ihrer Trennung aus Rohgemischen beeinflussen, gelten die Grundprinzipien der präparativen Chromatographie noch immer. Während das Standardprotokoll zur Peptidtrennung mit einem generischen Gradienten (wie 5 – 50 % B oder 5 – 95 % B) auf einer Umkehrphasensäule in den meisten Fällen verwendet werden kann, müssen für Peptide mit einzigartigen Eigenschaften manchmal Trennmethoden entwickelt werden, um die Anforderungen an Reinheit, Beladung oder Ausbeute zu erfüllen. Trennmethoden können häufig durch Änderung des Lösungsmittels der mobilen Phase, des Modifikators, der Gradientensteigung, der Temperatur, des pH-Werts oder der Probenzuführungsmethode verbessert werden. Jeder dieser Faktoren beeinflusst die Trennung, die Qualität der Chromatographie und den letztendlichen Erfolg der Trennung.

Rolle des Lösungsmittels

Die mobile Phase besteht aus drei Komponenten, dem schwachen Lösungsmittel, dem starken Lösungsmittel und dem Modifikator. Bei der Umkehrphasenchromatographie ist das schwache Lösungsmittel fast immer Wasser. Obwohl Methanol, Ethanol oder Isopropanol als starke Lösungsmittel in Betracht gezogen werden können, ist Acetonitril aufgrund seiner niedrigen Viskosität, etwas höheren Lösungsmittelstärke und seiner Verwendbarkeit im UV-Detektionsbereich niedriger Wellenlänge (185 – 205 nm) in der Regel das Lösungsmittel der Wahl. Acetonitril liefert normalerweise die beste Peakform, ist leicht zu verdampfen und verringert die Anzahl der Nebenreaktionen, die während der Trennung und Aufarbeitung ablaufen können. Eine gute UV-Transparenz ergibt ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis für eine bessere Peakerkennung. Einige Anwender können jedoch Einwände gegen die Verwendung von Acetonitril haben, wenn sie das Peptid in biologischen Tests verwenden möchten.

Der Ersatz eines Alkohols, wie z. B. Ethanol, verringert die Resttoxizität, die mit Acetonitril verbunden sein kann. Neben Bedenken hinsichtlich der Biokompatibilität erhöhen Propanol oder Acetonitril:Propanol-Gemische häufig die Löslichkeit großer oder hydrophober Peptide und brechen Aggregate auf, die sich manchmal in Lösung bilden. Die Wirkung von 70 % Isopropanol:30 % Acetonitril auf das basische Peptid ist in Abbildung 12 dargestellt. Die Auflösung des Hauptpeaks in Bezug auf die am nächsten eluierenden Verunreinigungen wird verbessert und die Retentionszeit wird um etwa die Hälfte reduziert. Bei mobilen Phasen, die Alkohole enthalten, sind aufgrund der höheren Viskosität in der Regel erhöhte Säulentemperaturen erforderlich.

Rolles des Modifikators der mobilen Phase

Die Trennung von Peptiden mithilfe von Umkehrphasenchromatographie erfordert die Zugabe eines polaren Modifikators zur mobilen Phase, da Peptide sowohl positive (Aminoterminus) als auch negative Ladungen (Carboxylterminus) aufweisen, die die Affinität für die hydrophobe Oberfläche des Packungsmaterials verringern. Die Schutzgruppen der Seitenkette können ebenfalls eine Ladung tragen, wie in Abbildung 13 gezeigt. Modifikatoren steuern den pH-Wert, um den Ionisierungsgrad der schwach sauren oder basischen Seitenketten zu verändern. Der Modifikator kann auch mit dem Peptid Ionenpaare bilden. Die Trennung einer bestimmten Probe kann durch Manipulation dieser Mechanismen optimiert werden.

Ameisensäure senkt den pH-Wert der mobilen Phase, wodurch die sauren Seitenketten des Peptids protoniert werden und ein Teil der negativen Ladung entfernt wird (Abbildung 14). Die reduzierte Anzahl geladener Aminosäureseitenketten erhöht die Anziehungskraft der hydrophoben Oberfläche der Säule, was eine bessere Trennung fördert. Obwohl die meisten Silanole auf der Oberfläche der Säule ebenfalls protoniert sein können, stehen dennoch freie Silanole für die Bindung mit dem Peptid zur Verfügung. Diese Peptid-Silanol-Wechselwirkungen erscheinen als Tailing-Peaks im Chromatogramm.

Trifluoressigsäure (TFA), der am häufigsten verwendete Modifikator, unterscheidet sich durch den Wechselwirkungsmechanismus mit der Säule und Probe (Abbildung 15). Der niedrige pH-Wert protoniert saure Peptidseitenketten und Ionenpaare neutralisieren basische Seitenketten, wodurch deren Bindung an freie Silanole, die Peak-Tailing verursachen, verhindert wird. Die Kombination aus verringerter Ladung und Ionenpaarung erhöht die Retention, wodurch eine höhere Konzentration an organischem Lösungsmittel zur Elution erforderlich ist.

Der Vorteil der Verwendung einer Säule mit verbrückten Ethyl-Hybridpartikeln ist die Beseitigung von Silanol-Wechselwirkungen (Abbildung 16). TFA wird nicht mehr benötigt, um das Peak-Tailing zu reduzieren, da die Basenpackung weniger Wechselwirkungen mit dem Peptid aufweist. Stattdessen kann entweder Ameisensäure (FA) oder TFA verwendet werden, um die Selektivität der Trennung zu verändern und gleichzeitig eine gute Peakform beizubehalten. Der Unterschied in der Retention sowie die Änderung der Elutionsreihenfolge können verwendet werden, um die Aufreinigungsbedingungen anzupassen, wie in Abbildung 17 gezeigt. Das Sternchen identifiziert das gleiche verunreinigte Peptid in den beiden Trennungen, was die beträchtliche und nützliche Veränderung der Selektivität bestätigt.

Rolle eines erhöhten pH-Werts

Durch Anheben des pH-Werts kann auch die Wechselwirkung zwischen dem Peptid und die Säulenoberfläche des verbrückten Ethyl-Hybrids verändert werden. Bei Puffern wie Ammoniumbicarbonat werden die sauren Peptidseitenketten durch den hohen pH-Wert deprotoniert und ionisiert (Abbildung 18). Das Ammoniumbicarbonat deprotoniert und neutralisiert auch die basischen Peptidseitenketten, wodurch die Ladung des Peptids verringert und seine Anziehungskraft auf die hydrophobe Säulenoberfläche erhöht wird. Die basischen Peptidseitenketten binden nicht an die wenigen verbleibenden Silanole und das Peak-Tailing wird reduziert. Zusätzlich zu diesen Vorteilen ist Ammoniumbicarbonat flüchtig und relativ leicht aus dem gereinigten Peptidprodukt zu entfernen. Ammoniumhydroxid (0,1 %) kann auch verwendet werden, um den pH-Wert der mobilen Phase zu erhöhen und lässt sich leicht aus den gesammelten Fraktionen verdampfen.

Extreme pH-Werte verändern die Selektivität der Trennungen (Abbildungen 19 und 20). Das saure Peptid (Abbildung 19) reteniert bei niedrigem pH-Wert besser auf der Umkehrphasenpackung, da alle negativen Ladungen neutralisiert werden und das Peptid stark mit der hydrophoben Säulenoberfläche in Wechselwirkung tritt. Bei hohen pH-Werten hingegen bewegt sich das Peptid aufgrund der größeren Anzahl negativer Ladungen zu einer früheren Retentionszeit, wodurch es daran gehindert wird, so stark an der Säulenpackung zu haften. Für dieses Beispiel bleibt die Peakform unverändert, die Änderung der Elutionsreihenfolge könnte jedoch zur Methodenentwicklung oder zur Charakterisierung des Peptids mit einer orthogonalen Strategie verwendet werden.

Das basische Peptid (Abbildung 20) zeigt bei den extremen pH-Werten erwartungsgemäß das entgegengesetzte Verhalten. Bei hohem pH-Wert sind die basischen Reste des Peptids deprotoniert und nicht ionisiert. Die starke Wechselwirkung des Peptids mit der Säule erfordert einen höheren Prozentsatz an organischer mobiler Phase, um es von der Säule zu eluieren. Die Änderung der Selektivität mit verbesserter Auflösung bei einem pH-Wert von 10 macht den höheren pH-Wert für das Ziel der Trennung von Peptiden mit erhöhter Reinheit attraktiver.

Zur Erinnerung: Während mobile Phasen bei niedrigen und hohen pH-Werten mit Säulen mit Hybridpartikeltechnologie kompatibel sind, sollten Methodenbedingungen bei extremen pH-Werten nicht mit Säulenpackungen auf Silikabasis verwendet werden. Ein zu niedriger pH-Wert spaltet die gebundene Phase. Ein hoher pH-Wert zerstört das Substrat der Silika-Partikelsäule. Überprüfen Sie immer die vom Hersteller empfohlenen pH-Bereichsgrenzen für bestimmte Säulen auf Silikabasis.

Rolle der Temperatur

Die Temperatursteuerung wird in der Chromatographie am häufigsten verwendet, um reproduzierbare Trennungen sicherzustellen. Bei der Trennung und Aufreinigung ist sie aus mehreren zusätzlichen Gründen wertvoll. Hydrophobe Peptide mit begrenzter Löslichkeit gehören zu den am schwierigsten aufzureinigenden Proben. Eine Erhöhung der Trenntemperatur erhöht die Löslichkeit hydrophober Peptide und verbessert normalerweise ihre chromatographische Peakform. Dies verbessert letztendlich die Reinheit und Wiederfindung der Trennung, wodurch die Trennung schneller und effizienter wird.

Da unterschiedliche Temperaturen zu unterschiedlichen chromatographischen Selektivitäten führen, ist das Beheizen der Säule sehr praktisch, um die Trennung einer bestimmten Probe zu optimieren. Außerdem nehmen die Viskosität der mobilen Phase und der Gesamtsystemdruck mit steigender Temperatur ab. Ein niedrigerer Systemdruck verringert die Belastung des Systems, der Fittings und der Säule und erhöht letztendlich die Robustheit des Betriebs.

Während die Temperatursteuerung bei der analytischen Chromatographie Routine ist, wird die Temperatur aus zwei Gründen selten als Parameter zur Manipulation der Chromatographie im präparativen Maßstab verwendet: Erstens können Säulen mit großem Durchmesser nicht gleichmäßig von außen beheizt werden. Zweitens treten Trennungen mit hoher Flussrate tatsächlich bei der Temperatur des eintretenden Lösungsmittels auf. Elektrische Decken und Säulenöfen sind für Trennungen im kleinen Maßstab ausreichend, große Säulen können jedoch nicht gleichmäßig erhitzt werden. Über den Durchmesser und die Länge der Säule bilden sich Temperaturgradienten, die die Chromatographie nachteilig beeinflussen.

Ein effektives Beheizen der Säule wird erreicht, indem eine Lösungsmittel-Vorheizschleife am Kopf der Säule eingefügt wird und die Schleife und die Säule in ein Wasserbad, das auf die gewünschte Temperatur äquilibriert wurde, getaucht werden (Abbildung 21). Ein kontinuierlicher Fluss von Lösungsmittel durch die Vorheizschleife bringt die Säule intern in ein Gleichgewicht, während das Wasserbad die externe Säulenumgebung stabilisiert. Die Bandenverbreiterung, die der Lösungsmittel-Vorheizschleife zuzuschreiben ist, ist vernachlässigbar, da sie aus Kapillaren mit schmalem Innendurchmesser besteht. Die einfließende Probe wird ebenfalls durch Adsorption am Säulenkopf refokussiert.

Der Effekt der Temperatursteuerung für Peptidtrennungen wird für zwei der Peptide der Testgruppe gezeigt: das basische Peptid (Abbildung 22) und das saure Peptid (Abbildung 23). In diesen Beispielen (rot hervorgehoben) werden die Probenkomponenten des basischen Peptids bei 60 °C besser getrennt, während die Komponenten der sauren Peptid-Rohmischung bei 40 °C besser aufgelöst werden. Diese Beobachtungen sind jedoch rein zufällig, da eine Vorhersage der optimalen Temperatur entweder für saure oder basische Peptide nahezu unmöglich ist und von den spezifischen Eigenschaften der einzelnen Sequenzen abhängt.

Eine Änderung des Lösungsmittels, des Modifikators für die mobile Phase, des pH-Werts und der Temperatur hat einen dramatischen Einfluss auf die Peptidtrennung. Jeder dieser Parameter kann allein oder zusammen als Hilfsmittel zur Methodenentwicklung zur Optimierung der Chromatographie verwendet werden. Eine einzelne Säule, die mit stabilen Hybridpartikeln gepackt ist, wie die XBridge Peptide BEH Säulentechnologie, kann den Aufreinigungsprozess vereinfachen, indem die Anzahl der Säulen und die Screening-Zeit, die für die Peptidtrennung erforderlich sind, reduziert wird. Die Chromatographie des basischen Peptids in Abbildung 24 veranschaulicht den Einfluss, den kleine Änderungen auf die Trennung haben. Bei Peptiden mit einzigartigen Eigenschaften können andere Säulenchemikalien zur Optimierung der Trennung nützlich sein.

Fokussieren des Gradienten

Für chromatographische Trennungen zur Trennung und Aufreinigung gelten die gleichen physikalischen und chemischen Prinzipien wie für analytische Trennungen. In präparativen Experimenten isolieren Wissenschaftler jedoch Verbindungen mit hohen Massenbeladungen oft auf großen Säulen, und benötigen eine bessere Auflösung, um die Reinheit und Wiederfindung des gesammelten Produkts zu erhöhen. Das Erstellen eines flachen Gradienten ist ein guter erster Ansatz zur Verbesserung der Auflösung, aber eine Änderung der Gradientensteigung für die gesamte Trennung kann die Peaks breiter machen und die Gesamtlaufzeit verlängern. Segmentierte und fokussierte Gradienten verringern die Gradientensteigung nur für den Teil der Trennung, der die erhöhte Auflösung erfordert, ohne die Gesamtlaufzeit zu erhöhen (Abbildungen 25 und 26).

Lineare Gradienten von niedriger zu hoher organischer Zusammensetzung (d. h.., 5 – 50 % B oder 5 – 95 % B) entwickeln sich über einen definierten Zeitraum und werden oft zum Screening von Proben verwendet. Sie können auch für die präparative Chromatographie eingesetzt werden, wenn eine gute Auflösung zwischen den Probenkomponenten vorliegt und die Laufzeit relativ kurz ist. Segmentierte Gradienten behalten vor und nach dem flacheren, fokussierten Teil der Methode die gleiche Steigung bei, sodass das chromatographische Profil für diese Teile der Trennung beibehalten wird. Der flachere, fokussierte Teil des Chromatogramms hat eine verringerte Gradientensteigung, wodurch eng eluierende Verunreinigungen effektiv vom interessierenden Peak wegbewegt werden.

Fokussierte Gradienten zielen nur auf das Produkt ab. Die Lösungsmittelstärke wird von niedrigen Konzentrationen, die für die Probenbeladung verwendet wurden, schnell auf etwa 5 Prozent unter dem erwarteten Elutionspunkt für den Produktpeak erhöht. Im Allgemeinen verläuft der flache Teil des Chromatogramms bei etwa einem Fünftel der Steigung der ursprünglichen Trennung bis etwa 3 Prozent über der erwarteten Elution für den Produktpeak. Sobald der flache Teil des Gradienten beendet ist, wird der Prozentsatz der organischen mobilen Phase rasch erhöht, um die Säule von etwaigen verbleibenden Verunreinigungen zu reinigen. Aufgrund der Komplexität von Peptidgemischen liegt die beste Auflösung häufig bei 0,25 % – 0,33 % Änderung/Säulenvolumen, eine etwas flachere Steigung als das typische Fünftel der ursprünglichen Steigung des Screening-Gradienten, die für kleine Moleküle und weniger komplexe Peptidproben verwendet wird.

Das Systemvolumen wird beim Entwerfen des fokussierten Gradienten sowie bei der grundlegenden Skalierung vom analytischen zum präparativen Maßstab verwendet. Das Systemvolumen, auch Verzögerungsvolumen oder Dwell-Volumen genannt, ist definiert als das Volumen vom Punkt der Gradientenbildung bis zum Kopf der Säule und umfasst alle Komponenten des HPLC-Flusswegs, der Pumpenköpfe, der Pulsationsdämpfer, der Mischer, der Injektorschleife und der Schläuche. Bei der geometrischen Skalierung, bei der die Steigung sowohl auf der analytischen als auch auf der präparativen Skala beibehalten wird, legt das Systemvolumen einen isokratischen Halt fest, bevor der Gradient beginnt. Dieser Halt kann im kleinen Maßstab mehrere Säulenvolumina oder im großen Maßstab ein Bruchteil eines Säulenvolumens sein. Ein programmiertes isokratisches Halten bei Anfangsbedingungen wird verwendet, um den Unterschied im Systemvolumen zwischen der analytischen und der präparativen Skala auszugleichen, wodurch sichergestellt wird, dass der tatsächliche Gradient exakt zur gleichen Zeit startet.

Unter Verwendung eines Stufengradienten (Tabelle 3), bei dem das Lösungsmittel der mobilen Phase A unverdünnt ist und das Lösungsmittel der mobilen Phase B einen geeigneten UV-Absorber enthält (d. h. Aceton bei 2 mL/L), kann das Systemvolumen mithilfe der in den Abbildungen 27 und 28 gezeigten Vorgehensweise und Berechnungen leicht berechnet werden.

Tabelle 3. Stufengradienten zur analytischen und präparativen Bestimmung des Systemvolumens

Es ist zwar möglich, das Systemvolumen, das Säulenvolumen und den prozentualen Anteil des starken Lösungsmittels, das das Peptid eluiert, abzuschätzen und dann aus diesen Abschätzungen den segmentierten oder fokussierten Gradienten zu erstellen, um Zeit zu sparen. Es ist jedoch lohnenswert, das Systemvolumen experimentell zu bestimmen und diese Werte für spätere Experimente aufzuzeichnen. Das Systemvolumen bleibt konstant, solange keine Änderungen an den HPLC-Leitungen vorgenommen werden und die Flussrate der Methode mit der Flussrate identisch ist, die zur Messung des Systemvolumens verwendet wird. Sobald das Systemvolumen experimentell bestimmt wurde, sind Modifikationen am System (wie die Änderung der Größe der Injektorschleife) einfach zu berechnen und erfordern keine zusätzliche Volumenmessung. Sobald das Systemvolumen bestimmt ist, kann es bei fokussierten Gradientenberechnungen verwendet werden.

Entwerfen des fokussierten Gradienten

Fokussierte Gradienten werden normalerweise auf der Grundlage der Analyse der rohen Probenmischung entwickelt, das Verfahren ist jedoch für das Modifizieren eines Gradienten identisch, der bereits in einem ersten präparativen Lauf verwendet wurde. Mithilfe der unten gezeigten Gleichungen lässt sich ein fokussierter Gradient ganz einfach erstellen. Angenommen, der folgende Gradient ist der, aus dem der fokussierte Gradient erstellt wird: Säule 4,6 x 100 mm, Systemvolumen 1,0 mL, Säulenvolumen 1,097 mL*
Peakretentionszeit = 7,76 min

*Das Säulenvolumen kann mit einem im Internet verfügbaren Rechner oder mit dem Volumen eines Zylinders bestimmt werden: V = πr2h. Die Werte unterscheiden sich je nach ausgewählter Methode geringfügig, da einige Rechner das Flüssigkeitsvolumen aufgrund der Säulenpackung reduzieren. Solange dieselbe Methode für alle Berechnungen verwendet wird, hat dies keine Auswirkungen auf die Chromatographie.

Abbildung 29 zeigt das Chromatogramm des synthetischen Rohpeptids, das mit diesem Gradienten analysiert wurde.
Berechnen des Offsets zwischen dem Punkt der Gradientenbildung und dem Detektor

Offset = Systemvolumen + Säulenvolumen

Beispiel:
Offset = 1,0 mL + 1,097 mL
Offset = 2,097 mL
Berechnen der Zeit, die das Lösungsmittel benötigt, um den Detektor zu erreichen
Zeit bis zum Detektor = Offset in mL
Flussrate in mL/min

Beispiel:
Zeit bis zum Detektor = 2,097 mL/1,46 mL/min
Zeit bis zum Detektor = 1,43 min

Berechnen der Zeit, zu der die Elutions-Peakkonzentration gebildet wurde

Zeitliche Elutionskonzentration =
Peakretentionszeit – Zeit bis zum Detektor – Gradienten-Haltevolumen

Beispiel:
Zeitliche Elutionskonzentration = 7,76 min – 1,43 min – 0,00 min
Zeitliche Elutionskonzentration = 6,33 min

Berechnen der Peakelution %

% Elutionskonzentration =
Zeit Elutionskonzentration/Länge Pilot x Pilotwechsel /
Gradientensegment + anfänglicher Pilotgradient % / Gradientensegment

Beispiel:
% Elutionskonzentration = 6,33 min / 10 min x 45 % + 5 %
% Elutionskonzentration = 33,48 %

HINWEIS: Verwenden Sie für alle prozentualen Berechnungen nur absolute Werte, d. h. 45 x 6,33 min, nicht 0,45 x 6,33.

Berechnen der Steigung des Pilotgradienten in % Änderung pro Säulenvolumen

# Säulenvolumina (CV) =
1 CV x Flussrate in mL x Gradientensegmentzeit x mL min

Beispiel:
# Säulenvolumina = 1 CV x 1,46 mL x 10 min/1,097 mL min
# Säulenvolumina = 13,3 CV

Beispiel:
Steigung des Pilotgradienten = Änderung des Pilotgradienten in %
Steigung des Pilotgradienten = 45 % / 13,3 CV = 3,38 % / CV

Berechnen der Steigung des fokussierten Gradienten in % Änderung pro Säulenvolumen. Verwenden Sie ein Fünftel der Steigung des Pilotgradienten.

Fokussierte Gradientensteigung in %/CV = 1/5 × Pilotgradientensteigung

Beispiel:
Fokussierte Gradientensteigung = 1 x 3,38 %/5 CV
Fokussierte Gradientensteigung = 0,67 %/CV

Erstellen eines fokussierten Gradientensegments von 5 % unter bis 3–5 % über dem geschätzten Elutionsprozentsatz. Der Peak eluiert bei 33,5 % Acetonitril. Der flache Gradient sollte von 28 % bis 36 % Acetonitril reichen. Berechnen der Zeit für das fokussierte Gradientensegment.

Zeitlich fokussiertes Gradientensegment =
% Änderung X Steigung des fokussierten Gradienten X Säulenvolumen X Flussrate in mL

Beispiel:
Zeitlich fokussiertes Gradientensegment =
8 % x 1 CV / 0,67 % x 1,097 mL / 1 CV x 1 min / 1,46 mL
Zeitlich fokussiertes Grad-Segment = 9,0 min

Schreiben des fokussierten Gradienten, beginnend mit den Anfangsbedingungen des Pilotlaufs und schnell ansteigend auf 5 % unterhalb des Elutionsprozentsatzes für den Peak.

Das obere Feld von Abbildung 30 zeigt das Chromatogramm des Rohpeptids an, das unter Verwendung des fokussierten Gradienten analysiert wurde. Die eng eluierenden Verunreinigungen werden besser aufgelöst, aber eine Verringerung der Steigung auf etwa ein Zehntel der anfänglichen Steigung (unteres Feld) ergab die beste Auflösung der Verunreinigungen. Dieses Beispiel veranschaulicht deutlich den Einfluss, den eine Verringerung der Steigung auf 0,25 – 0,33 % Änderung pro Säulenvolumen auf die Trennung eines komplexen Peptidgemisches haben kann. Beachten Sie, dass die Retentionszeit des Hauptpeptid-Peaks immer noch ca. 7 Minuten beträgt, was ungefähr der Zeit des ursprünglichen Screening-Gradienten entspricht. Durch Fokussieren des Gradienten wurde daher die Auflösung erhöht, ohne die Laufzeit zu erhöhen. Während die Gesamtlaufzeit für den Gesamtgradienten länger ist, können andere Techniken, wie z. B. die vorzeitige Beendigung des Laufs, verwendet werden, um den Trennungsprozess in größerem Maßstab zu beschleunigen. Dieses Peptid wurde schließlich durch geometrische Skalierung des flacheren fokussierten Gradienten isoliert.

Probenzuführung

Es gibt kein universelles Lösungsmittel oder Verfahren zum Auflösen synthetischer Peptide, da die Peptidzusammensetzung und -sequenz die Löslichkeit direkt beeinflusst. Zu den geeigneten Lösungsmitteln gehören Wasser mit 0,1 – 2 % Trifluoressigsäure, Ameisensäure oder Essigsäure, Dimethylsulfoxid, Hexafluorisopropanol, 6 – 12 M Guanidin-HCl, Dimethylformamid, 0,1 % Ammoniumhydroxid oder 10 mM Ammoniumbicarbonat. Manchmal geben die Hersteller praktische Anleitungen zum Auflösen verschiedener Peptidtypen an. Das Auflösen des Peptids führt oft zu einem relativ großen Probenvolumen in einem starken Lösungsmittel.

In herkömmlichen präparativen Chromatographiesystemen (Abbildung 31) verzerren große Injektionsvolumina starker Probenverdünnungsmittel häufig das Chromatogramm, wodurch die Menge des Produkts, die erfolgreich isoliert werden kann, verringert wird. Mit zunehmender Beladung geht die Auflösung eng eluierender Verunreinigungen verloren. Ausfällungen der Probe aufgrund von wässriger mobiler Phase auf beiden Seiten der Probe in der Schleife oder am Kopf der Säule verringern die Robustheit des Systems und die Lebensdauer der Säule.

Bei herkömmlichen Trennungen beginnt eine Probe, die in DMSO oder einem anderen starken Lösungsmittel auf die Säule gegeben wird, sofort die Säule entlang zu wandern, wobei die Probenmoleküle mitgenommen werden (Abbildung 32). Die Probe wird erst reteniert, wenn das starke Lösungsmittel in der Säule verdünnt wird. Leider sind die Probenbanden zu dem Zeitpunkt, an dem sie auf der Säule retenieren, bereits breit und wandern auf dem Säulenbett ineinander über. Wenn die Probenkomponenten von der Säule eluieren, sind die Banden nicht ausgeprägt und die Reinheit der einzelnen Komponenten ist gering.

Die Verdünnung an der Säule (ACD, at-column dilution), eine alternative Injektionstechnik, ermöglicht die Injektion großer Volumina an starken Lösungsmitteln und verbessert gleichzeitig die Probenlöslichkeit, die Säulenbeladung und die Auflösung. Bei der ACD ist das Chromatographiesystem so angeschlossen, dass die Probe in einem starken Lösungsmittel am Kopf der Säule mit wässriger mobiler Phase verdünnt wird (Abbildung 33). Die Probe wird sehr schnell gemischt und an der Säule adsorbiert. Die Transferrate ist so hoch, dass keine Ausfällung auftreten kann. Das starke Lösungsmittel wird sofort von der Säule gespült, bevor die Probenelution beginnt.

Sobald der Gradient gestartet wurde, eluieren die Probenkomponenten als schmale, scharf aufgelöste Banden mit niedrigem Volumen (Abbildung 34).

Eine verbesserte Auflösung zwischen den Peaks der Probenkomponenten ermöglicht es, die Probengröße zu erhöhen und dadurch die Anzahl der zur Trennung erforderlichen Injektionen zu reduzieren. In der Praxis kann die Säulenbeladung mit der Verdünnung an der Säule oft um das Drei- bis Fünffache erhöht werden (Abbildung 42). Die Verdünnung an der Säule verbessert die Robustheit des Systems, da die Probe nur begrenzt in der Schleife oder am Säulenkopf ausfällt. Die Häufigkeit von Abschaltungen unter hohem Druck wird verringert und die Lebensdauer der Säule wird verlängert.

Praktisches Beispiel für eine Peptidtrennung

Die Grundsätze der präparativen Chromatographie gelten für alle Arten von Molekülen, einschließlich Peptiden. Das folgende Beispiel veranschaulicht einen typischen Arbeitsablauf zur Trennung eines Peptids in einer Forschungsumgebung und wendet die oben vorgestellten Faktoren zur Methodenoptimierung an. Das Verfahren kann je nach den Prozessanforderungen des Labors modifiziert werden.

Das in diesem Beispiel verwendete Peptid war 17 Aminosäuren lang mit 3 basischen, 2 sauren, 8 unpolaren und 4 polaren Resten. Die Probe wurde durch Vortexen und Beschallen in Dimethylsulfoxid aufgelöst und dann durch einen 0,45 µm GHP Acrodisc Spritzenvorsatzfilter geleitet. Die monoisotopische Masse des Peptids betrug 1772,9 Da und wies die folgenden Ladungszustände auf:
[M+H]⁺ = 1773,9
[M+2H]²⁺ = 887,5
[M+3H]³⁺ = 592,2
[M+4H]⁴⁺ = 447,2

Rohpeptidprofil

Die Rohpeptidprobe wurde mit zwei verschiedenen Modifikatoren (0,1 % Ameisensäure und 0,1 % Trifluoressigsäure) in der mobilen Phase analysiert, um festzustellen, welcher Modifikator die bessere Trennung ermöglicht. Während Acetonitril am häufigsten als organische Komponente der mobilen Phase verwendet wird, wurde in diesem Beispiel zur Veranschaulichung stattdessen Isopropanol verwendet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 35 dargestellt, wo der TFA-Modifikator (A und B) im Vergleich zu Ameisensäure (C und D) bei 40 °C einen schärferen Produktpeak mit gut aufgelösten Verunreinigungen erzeugte. Die Trennung wurde auch bei 25 °C und 60 °C bewertet, aber bei 40 °C zeigte sich die beste Peakform und Auflösung der Peaks der Probenkomponenten (Abbildung 36). Die leicht erhöhte Temperatur verringerte auch den Systemrückdruck, der auf Isopropanol als organische Komponente der mobilen Phase zurückzuführen ist.

Fokussieren des Gradienten

Nachdem der Modifikator der mobilen Phase und die Temperatur für die Analyse des Rohmaterials optimiert wurden, wurde der Gradient fokussiert, um die Auflösung eng eluierender Verunreinigungspeaks zu verbessern. Die Säule mit den Abmessungen 4,6 × 50 mm hatte ein Volumen von 0,698 mL und das Systemvolumen wurde mit 0,77 mL gemessen. Die für die rohe Peptidanalyse verwendete HPLC-Methode ist unten gezeigt:

Berechnen des Offset zwischen dem Punkt der Gradientenbildung und dem Detektor

Offset = Systemvolumen + Säulenvolumen

Beispiel:
Offset = 0,77 mL + 0,698 mL
Offset = 1,468 mL

Berechnen der Zeit, die das Lösungsmittel benötigt, um den Detektor zu erreichen

Zeit bis zum Detektor =
Offset in mL/Flussrate in mL/min

Beispiel:
Zeit bis zum Detektor = 1,468 mL / 1,46 mL/min
Zeit bis zum Detektor = 1,00 min

Berechnen der Zeit, zu der sich die Peak-Elutionskonzentration gebildet hat

Zeit der Elutionskonzentration =
Peakretentionszeit – Zeit bis zum Detektor – Gradienten-Haltevolumen

Beispiel:
Zeitliche Elutionskonzentration = 3,23 min – 1,00 min – 0,50 min
Zeitliche Elutionskonzentration = 1,73 min

Berechnen der Peakelution %

% Elutionskonzentration =
Zeit Elutionskonzentration / Länge Pilot x Wechsel Pilot / Gradientensegment +
Anfänglicher Pilotgradient % / Gradientensegment

Beispiel:
% Elutionskonzentration = 1,73 min x 30 % + 0 %/4,78 min
% Elutionskonzentration = 10,85 %

HINWEIS: Verwenden Sie für alle prozentualen Berechnungen nur absolute Werte, d. h. 30 × 1,73 min, nicht 0,30 × 1,73.

Berechnen der Steigung des Pilotgradienten in % Änderung pro Säulenvolumen

# Säulenvolumina (CV) =
1 CV X Flussrate in mL X Gradientensegmentzeit X mL min

Beispiel:
#Säulenvolumina = 1 CV x 1,46 mL x 4,78 min / 0,698 mL min
# Säulenvolumina = 9,99
Steigung des Pilotgradienten = % Änderung des Pilotgradienten
# Säulenvolumina

Beispiel:
Steigung des Pilotgradienten = 30 % / 9,99 CV = 3,0 % / CV

Berechnen der Steigung des fokussierten Gradienten in % Änderung pro Säulenvolumen. Verwenden Sie ein Fünftel der Steigung des Pilotgradienten.

Fokussierte Gradientensteigung in %/CV =
1/5 X Pilot-Gradientensteigung

Beispiel:
Fokussierte Gradientensteigung = 1 x 3,0 % / 5 CV
Steigung des fokussierten Gradienten = 0,6 % / CV


Erstellen des fokussierten Gradientensegments von 5 % unterhalb 3 – 5 % oberhalb des geschätzten Elutionsprozentsatzes. Der Peak eluierte bei 10,85 % Acetonitril, daher wurde der flache Gradient so konzipiert, dass er von 5 – 13 % Acetonitril in 6,37 Minuten gemessen wird.

Zeitlich fokussiertes Grad-Segment =
% Änderung X Steigung des fokussierten Gradienten X Säulenvolumen X Flussrate in mL

Beispiel:
Zeitlich fokussiertes Gradient-Segment = 8 % / 0,6 % x 0,698 mL / 1 CV x 1 min / 1,46 mL
Zeitsegment des fokussierten Gradienten = 6,37 min


Schreiben des fokussierten Gradienten, beginnend mit den Anfangsbedingungen des Pilotlaufs und schnell ansteigend auf 5 % unterhalb des Elutionsprozentsatzes für den Peak.

Sobald der fokussierte Gradient erstellt wurde, wurde die Trennung der Rohpeptidprobe ausgewertet (Abbildung 37A). Ein kleiner Verunreinigungspeak eluierte kurz vor dem Produktpeak, der jedoch kaum wahrnehmbar war. Bei der doppelten Beladung (Abbildung 37B, 72 µg) war die Verunreinigung sichtbarer, der Hauptpeak war jedoch immer noch relativ rein. Das Vierfache der ursprünglichen Beladung von 36 µg erzeugte ein Chromatogramm, in dem die Verunreinigung ausgeprägter war, und würde höchstwahrscheinlich die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens eines reinen Produkts verringern, wenn diese Beladung geometrisch auf die größere Säule für die Vorbereitung skaliert würde (Abbildung 37C). Bei einer Beladung mit 256 µg der analytische Trennsäule koeluierte die Verunreinigung vollständig mit dem Hauptpeak (Abbildung 37D).

Skalierung zur Vorbereitung

Die Beladung der analytischen Trennsäule mit 72 µg wurde für die geometrische Skalierung zur Vorbereitung ausgewählt. Diese vorsichtige Beladung würde die Wahrscheinlichkeit erhöhen, mit weniger Injektionen eine vertretbare Menge an reinem Material zu erhalten, als das kleinste Injektionsvolumen zu skalieren. Die Massenbeladung ist proportional zum Säulenvolumen und wird mithilfe eines Prep-Umrechners oder durch Lösen von M2 in der folgenden Gleichung bestimmt:

M1 ist die Massenbeladung auf Säule 1, M2 ist die Massenbeladung auf Säule 2
L1 ist die Länge und d1 der Durchmesser von Säule 1, L2 ist die Länge und d2 der Durchmesser von Säule 2

M2 = M1 x L2 / L1 x d22 / d12
M2 = 72 μg x 100 mm / 50 mm x 19 mm2 / 4,6 mm2

M2 = 72 μg × 36.100 / 1058
M2 = 2456 μg oder 2,4 mg

44,03 mg Rohpeptid wurden in 5 mL DMSO gelöst und filtriert (Konzentration 8,80 mg/mL). Die geometrische Skalierung der 72-µg-Beladung der analytischen Trennsäule 4,6 × 50 mm auf die präparative Säule 19 × 100 erforderte eine Injektion von 2,4 mg, wie oben berechnet. Mit einer Rohpeptidkonzentration von 8,80 mg/mL wurde das Injektionsvolumen berechnet:

Injektionsvolumen = 2,4 mg X 1 mL / 8,80 mg/mL
Injektionsvolumen = 0,272 mL oder 272 μL

Der analytisch fokussierte Gradient wurde zur Vorbereitung skaliert, wobei die Systemvolumina auf beiden Skalen berücksichtigt wurden (Tabelle 4). Während das Dwell-Volumen beim präparativen System hoch zu sein schien, enthielt es eine 5-mL-Vorheizschleife zum Erhitzen der Säule sowie eine 2-mL-Injektionsschleife. In Anbetracht dieses Beitrags zum Systemvolumen waren die 2,75 mL, die auf die verbleibenden Systemschläuche zurückzuführen sind, recht angemessen. Der Produktpeak wurde nach Zeit gesammelt (Abbildung 38).

Tabelle 4. Gradienten-Skalierung

• Säule: 4,6 × 50 mm Säule: 19 × 100 mm
• System-Dwell-Volumen: 0,77 mL System-Dwell-Volumen: 9,75 mL
• Säulenvolumen: 0,698 mL Säulenvolumen: 23,804 mL
• System-Dwell-Volumen (in Säulenvolumina): 1,10 System-Dwell-Volumen (in Säulenvolumina): 0,41 Gradienten-Offset: 0,66

Fraktionsanalyse

Der Peptidproduktpeak wurde in zwei Fraktionen gesammelt. Diese beiden Fraktionen waren sehr rein, wie in Abbildung 39 gezeigt. Der breite Peak, der in jeder der Fraktionsanalysen und in der Blindprobe bei etwa 2,25 Minuten eluiert wurde, war höchstwahrscheinlich auf die niedrige Konzentration des Ionenpaarreagenzes Trifluoressigsäure in der mobilen Phase zurückzuführen. Die hydrophoben Bestandteile der TFA sammeln sich normalerweise auf der Säule an und eluieren dann während des Gradienten. Die Verunreinigung stammte nicht von Systemkomponenten wie dem Injektor oder dem Ventil, da ein weitere Blindprobe ohne Säule keine Peaks im Chromatogramm zeigte (Abbildung 40).

Verdünnung an der Säule

Auch wenn das Peptid mit hoher Reinheit isoliert wurde, würde eine Erhöhung der Probenbeladung pro Injektion die Prozesseffizienz verbessern und die Anzahl der chromatographischen Läufe verringern, die erforderlich sind, um die erforderliche Produktmenge für die nachfolgenden Experimente zu reinigen. Wie bereits erwähnt, kann die Verdünnung an der Säule mit einer einfachen Änderung der Systemkapillare sehr effektiv höhere Probenmengen bewältigen (Abbildung 33).

Obwohl die Änderungsrate von % B pro Säulenvolumen für die Peptidtrennung mithilfe der Verdünnung an der Säule die gleiche war wie für die konventionelle Trennung mit geometrischem Maßstab, wurde die programmierte Gradiententabelle modifiziert, um den Beitrag des organischen Lösungsmittels zu berücksichtigen, das durch die zusätzliche Probenladepumpe eingeführt wurde (Tabelle 5).

Tabelle 5. Gradientenvergleich: konventionelle Methoden und Methoden zur Verdünnung an der Säule

Gradientenzeit: 14,40 – 1,66 = 12,74 min Gradientenzeit: 16,00 – 3,26 = 12,74 min
Gradientenvolumen: 12,74 min × 25 mL/min = 318,5 mL Gradientenvolumen: 12,74 min × 25 mL/min = 318,5 mL
Säulenvolumina: 318,5 mL × 1 CV/23,804 mL = 13,38 CV Säulenvolumina: 318,5 mL × 1 CV/23,804 mL = 13,38 CV
Gradientensteigung: 8 %/13,38 CV = 0,6 % / CV Gradientensteigung: 8 %/13,38 CV = 0,6 % / CV
Flussrate der Ladepumpe während des Gradienten = 1,25 mL/min
1,25 mL/min = 5 % des Gesamtflusses
Gesamtflussrate der Gradientenmethode = 25 mL/min

Die Pumpe zur Verdünnung an der Säule leitet organisches Lösungsmittel direkt in die Probenschleife und ist auf einen Betrieb mit 5 % der Gesamtflussrate programmiert. Die Flussrate der Chromatographiepumpe wird daher von 25 mL/min bei der herkömmlichen Methode auf 23,75 mL/min bei der Methode zur Verdünnung an der Säule verringert. Beachten Sie, dass die Gesamtflussrate immer noch 25 mL/min beträgt (23,75 mL/min + 1,25 mL/min). Da die Pumpe zur Verdünnung an der Säule direkt an den Injektor angeschlossen ist, wird zu Beginn des Gradienten ein Halteschritt bei dem Anfangszustand eingefügt, der lang genug ist, um den vollständigen Transfer der Probe von der Schleife zur Säule sicherzustellen. Dieses System ist mit einer 2-mL-Schleife konfiguriert und der ursprüngliche Halteschritt betrug 0,66 min.

Berechnen des Halteschritts für die Methode zur Verdünnung an der Säule: 2 mL Schleife x (1 min/1,25 mL) = 1,6 min
1,60 min + 0,66 min Halteschritt von der ursprünglichen Vorbereitungsmethode = 2,26 min Halteschritt für die Methode zur Verdünnung an der Säule.

Die Prozentsätze der Gradientenmethode von A und B werden ebenfalls modifiziert, um den Beitrag der Pumpe zur Verdünnung an der Säule widerzuspiegeln. Der fokussierte Gradient beginnt bei 5 % B und geht bis zu 13 %. Da 5 % des Gesamtflusses bei einer konstanten Flussrate von 1,25 mL/min Isopropanol von der Pumpe zur Verdünnung an der Säule abgegeben werden, sind die Prozentsätze von B in der Methode zur Verdünnung an der Säule auf 0 % bzw. 8 % B programmiert. Beachten Sie, dass die Methode zur Verdünnung an der Säule etwas anders programmiert ist, der tatsächliche Gradient jedoch mit der herkömmlichen Methode identisch ist. Da dieses Peptid bei einem so niedrigen Prozentsatz von B eluiert, ist die tatsächliche Zeit, die bei 5 % B verbracht wird, bei der Methode zur Verdünnung an der Säule länger, da die Zeit, die bei der konventionellen Vorbereitungsmethode für den Wechsel von 0 % B zu 5 % B aufgewendet wird, in die Haltezeit bei der Methode zur Verdünnung an der Säule einfließt. Diese beiden Schritte sind in der Methode zur Verdünnung an der Säule aus Gründen der Übersichtlichkeit in getrennten Zeilen programmiert. Da die Prozentsätze von B verringert werden, um die von der Pumpe zur Verdünnung an der Säule gelieferten 5 % B zu berücksichtigen, müssen die Prozentsätze von A um 5 % erhöht werden, damit der Gradient mit der ursprünglichen konventionellen Injektionsmethode identisch bleibt. Wenn das Chromatographiesystem Spülschritte in der Injektionssequenz enthält, stellen Sie sicher, dass alle Spülleitungen mit starkem Spüllösungsmittel eingespült und gefüllt sind.

Da die geometrische skalierte Trennung im großen Maßstab bei 40 °C durchgeführt wurde, wurde die Temperatur für die Injektion mithilfe der Verdünnung an der Säule aufrechterhalten. Die Lösungsmittel-Vorheizschleife wurde kurz vor dem T-Stück in den wässrigen Lösungsmittelstrom eingeführt (Abbildung 41).

Die Lösungsmittel-Vorheizschleife, das T-Stück und die Säule wurden dann in das Wasserbad eingetaucht. Vor dem Start der Gradiententrennung ließ man den Druck stabilisieren, was bedeutete, dass die Äquilibrierung des Systems erreicht worden war. Während 2,4 mg Peptid die maximale Probenmenge war, die mit der konventionellen Leitungskonfiguration injiziert werden konnte, wurde die fünffache Menge, also 12 mg (1,36 mL), mit dem System in der Konfiguration mit Verdünnung an der Säule gegeben (Abbildungen 42 und 43). Die Fraktionen wurden nach Zeit gesammelt und anschließend mithilfe der ursprünglichen 0 – 30 % B-Screeningmethode analysiert. Die Fraktionen wiesen eine ausgezeichnete Reinheit auf und waren mit den Fraktionen vergleichbar, die bei der Vorbereitung mit der herkömmlichen Injektionstechnik gesammelt wurden (Abbildung 44).

Spezielle Hinweise zu hydrophoben Peptiden

Ein hydrophobes Peptid, bestehend aus 12 unpolaren und 3 polaren, ungeladenen Aminosäureresten, wurde in Dimethylsulfoxid gelöst. Der unten gezeigte präparative fokussierte Gradient wurde zur Trennung auf einer 19 × 100 mm Säule verwendet, wobei das Chromatographiesystem für die konventionelle Injektion angeschlossen war. Die extreme Hydrophobie des Peptids erforderte eine reduzierte Flussrate, eine geringere Probenbeladung und eine Temperatur von 60 °C.

Obwohl dieses Peptid ein guter Kandidat für die Verwendung der Verdünnung an der Säule ist, birgt die Erhöhung der Massenbeladung auf der Säule das Risiko einer Ausfällung. Da das Peptid bei etwa 50 % Acetonitril eluiert, liegt die Beladung dieser Probe mit 5 % B (wie im vorherigen Beispiel) so weit unter der erforderlichen Elutionsstärke, dass das Peptid bei der Verdünnung am Kopf der Säule zur Ausfällung neigt. Die Erhöhung des Anteils des organischen Lösungsmittels, das während des Beladungsschritts aus der Chromatographiepumpe kommt, mindert das potenzielle Ausfällungsproblem. Im Allgemeinen verhindert bei extrem hydrophoben Verbindungen die Verwendung eines anfänglichen Prozentsatzes an organischem Lösungsmittel in der Gradientenmethode, der 20 – 25 % unter dem erwarteten Prozentsatz der Elution der Verbindung liegt, eine Probenfällung, während die Vorteile der Technik zur Verdünnung an der Säule beibehalten werden. Der unten stehende Gradient der Verdünnung an der Säule wurde verwendet, um eine fünfmal größere Probe auf die 19 × 100 mm Säule zu laden (Abbildung 45).

Der Gradient startete bei 48 % B (43,6 % B + 5 % B von der Pumpe zur Verdünnung an der Säule) und endete bei 53 % Acetonitril in 29 Minuten mit einer Steigung von 0,49 % Änderung pro Säulenvolumen, was der Gradientenänderungsrate bei der konventionellen Injektion entspricht. Die Pumpe zur Verdünnung an der Säule förderte die Peptidprobe von der 5-mL-Schleife zum T-Stück in 100 % Acetonitril, wo sie im Anfangszustand der mobilen Phase der chromatographischen Pumpe 23,6 % B (18,6 % B + 5 % B von der Pumpe zur Verdünnung an der Säule) traf. Die Haltezeit von 9,2 Minuten zu Beginn der Methode stellte sicher, dass die Probe vollständig auf die Säule geladen wurde. Die Pumpe zur Verdünnung an der Säule lief mit einer konstanten Flussrate von 0,8 mL/min, was 5 % der Gesamtflussrate von 16,3 mL/min entsprach.

Alle Säulen müssen gelegentlich gereinigt werden, unabhängig davon, ob sie für Trennungen kleiner oder großer Moleküle verwendet werden. Ein hoher Rückdruck, ein hoher chromatographischer Hintergrund und zusätzliche Peaks, die nicht der Probe zugeordnet werden können, weisen darauf hin, dass die Säule gereinigt werden muss.

Die beste Methode, um die Lebensdauer der Säule zu verlängern, ist, die Ablagerung von Verunreinigungen auf der Säule zu verhindern. Es wird empfohlen, alle Proben vor der Injektion zu filtrieren. Das Hinzufügen eines integrierten Filters oder einer Vorsäule vor der Säule hilft dabei, Partikel und andere unerwünschte Gemischkomponenten aufzufangen. Das Spülen der Säule mit zwei bis drei Säulenvolumina eines hohen Prozentsatzes an organischem Lösungsmittel nach jeder Trennung ist nützlich, um unerwünschte Verunreinigungen systematisch zu entfernen. Schließlich hält die Verdünnung an der Säule die Proben in Lösung, verhindert ein Abschalten bei hohem Rückdruck und lässt die Probenkomponenten effektiv durch das Aufreinigungssystem laufen, unabhängig davon, ob ihr endgültiger Bestimmungsort ein Fraktioniergefäß oder der Abfallbehälter ist.

Ein hoher Rückdruck, der plötzlich auftritt, ist höchstwahrscheinlich auf eine Ausfällung der Probe irgendwo im System zurückzuführen – in der Probenschleife, den Leitungen, der Säule oder der Flusszelle des Detektors. Während das Chromatographiesystem pumpt, wird die Quelle des hohe Rückdrucks endgültig isoliert, wenn die HPLC-Fittings von der Abfallleitung ausgehend und zurück zu den Pumpen gelöst werden. Ein allmählicher Anstieg des Rückdrucks ist wahrscheinlich auf die Ablagerung von Verunreinigungen auf der Säule nach mehreren Injektionen zurückzuführen und kann auf verschiedene Weise behoben werden. Das Durchführen von wiederholten schnellen Gradienten bei erhöhter Temperatur, das Spülen der Säule über einen längeren Zeitraum in einem hohen Prozentsatz an organischem Lösungsmittel oder das Injizieren eines „Reinigungslösungsmittels“ wie DMSO oder 1 – 10 % Ameisensäure können verwendet werden, um unerwünschte Verunreinigungen von der Säule zu entfernen (Abbildung 46).

Zur Depyrogenisierung, der Entfernung endotoxischer Polysaccharide von der Säule, die das Endprodukt verunreinigen und allergische Reaktionen auslösen könnten, ist üblicherweise ein einstündiges und längeres Spülen mit 1 M Natriumhydroxid erforderlich. Dieses Verfahren ist mit den aktuellen Säulen nicht kompatibel.