Praktische Ansätze zur Peptidtrennung
Einführung
Peptide spielen eine einzigartige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffkandidaten und füllen eine spezielle Nische zwischen traditionellen niedermolekularen Therapien und größeren Proteinpräparaten. Aufgrund ihrer im Vergleich zu kleinen Molekülen höheren Wirksamkeit, Sicherheit und Verträglichkeit beim Menschen und ihrer im Vergleich zu Biopharmazeutika auf Proteinbasis geringeren Produktionskomplexität und -kosten sind Peptide als potenzielle Wirkstoffkandidaten für viele medizinische Erkrankungen zunehmend attraktiv. Synthetische Peptide können zur Untersuchung der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen zwischen zellulären Substraten verwendet werden oder selbst als Arzneimittel wirksam sein. Unabhängig davon, ob Peptide schrittweise mittels Festphasen-Peptidsynthese oder Lösungsphasen-Synthese hergestellt werden oder aus natürlich vorkommenden Quellen isoliert werden, sind fast alle Rohpeptidmischungen komplex und müssen aufgereinigt werden. Auch wenn die Synthesereaktionen sorgfältig kontrolliert werden, kommt es unweigerlich zur Bildung von Verunreinigungen, zu denen Deletionen, Trunkierungen oder chemisch veränderte Sequenzen gehören können, einschließlich Spaltungsaddukte oder andere Nebenprodukte, die während der Verarbeitung entstehen.
Der technologische Fortschritt der letzten Jahre in der analytischen Methodik hat auch die Verbreitung von Peptiden als Diagnostika und neue Therapeutika beeinflusst. Analysemethoden, die auf modernsten Geräten ausgeführt werden, zeigen eine verbesserte Empfindlichkeit und höhere Auflösung in kürzerer Zeit, was zu entscheidenden Zeiteinsparungen während der Produktion führt.
Synthetische Peptide bieten einzigartige Herausforderungen bei der Entwicklung einer Trennmethode. Für zukünftige Studien sind Reinheit und Ausbeute des Zielpeptids kritische Faktoren, die die experimentellen Ergebnisse beeinflussen. Wie oben erwähnt, kann die Zahl der Verunreinigungen, die aus der Synthese, Spaltung und Entschützung eines synthetischen Peptids resultieren, recht groß sein. Die Trennung des Peptidprodukts kann durch Anwendung der Prinzipien der Methodenentwicklung, die oft mit analytischer HPLC in Verbindung gebracht werden, verbessert werden. Die Trennmechanismen, die zur Erstellung einer Aufreinigungsmethode im größeren präparativen Maßstab verwendet werden, sind die gleichen Prinzipien wie im kleineren Maßstab. Säulenauswahl, Wahl des Modifikators für die mobile Phase, Verwendung der Temperatur und Gradientenoptimierung sind Optionen, die bei der Entwicklung jeder Trennmethode überprüft werden müssen. Die systematische Methodenentwicklung für Peptidtrennungen kann die Reinheit und Ausbeute des Produkts erheblich verbessern. Während die traditionelle Peptidtrennung normalerweise mithilfe von UV-gesteuerter Chromatographie durchgeführt wird, erleichtert die massengesteuerte Trennung zusammen mit einer sorgfältigen Methodenentwicklung den Aufreinigungsprozess durch eine bessere Unterscheidung zwischen dem Zielpeptid und den während der Synthese und Spaltung gebildeten Verunreinigungen.
Anforderungen an den Prozess der Peptidaufreinigung
Das Ziel jeder Trennstrategie ist es, so viel Probe wie möglich in so wenig Zeit wie möglich aufzureinigen, um die gewünschte Reinheit zu erhalten, die für die Durchführung der nachfolgenden Experimente erforderlich ist. Für das typische Labor, das viele verschiedene Peptide synthetisiert, ist es nützlich, ein standardisiertes Aufreinigungsprotokoll zu erstellen, das für die meisten Proben verwendet werden kann und bei Bedarf eine einfache Optimierung ermöglicht. Änderungen der Zusammensetzung der mobilen Phase, des Modifikators oder der Temperatur auf Säulen mit gleichbleibender Leistung von Lauf zu Lauf machen es überflüssig, mehrere Säulensätze für die Trennung zu verwenden. Diese wirtschaftlichen Optionen zur Verbesserung von Ausbeute und Reinheit sind unkompliziert und einfach zu implementieren. Der optimale Prozess der Peptidaufreinigung verwendet außerdem robuste Geräte, mit denen Trennungen in einem Bereich von analytischen und präparativen Maßstäben durchgeführt werden können. Bereits durch Austausch der Säule mit einem geeigneten Säulendurchmesser für die Trennung an einem vielseitigen Gerät mit großem Flussratenbereich wird die Aufreinigung effizient. Alle diese Faktoren zusammengenommen können die mit der Peptidaufreinigung verbundenen Gesamtkosten senken.
Arbeitsablauf der Peptidtrennung
Ein Standardprotokoll zur Peptidtrennung (Abbildung 1) beginnt mit der Festlegung der Menge an reinem Peptid, das für die Durchführung der nachfolgenden Experimente benötigt wird. Die Rohpeptidanalyse liefert eine vernünftige Schätzung der Probenreinheit und in Kombination mit der definierten Menge an reinem Peptid, die für spätere Studien benötigt wird, kann die geschätzte Massenbeladung berechnet werden. Die Massenbeladung definiert die Größe der präparativen Säule und damit die erforderliche Flussrate für das ausgewählte LC-Gerät.
Abbildung 1. Arbeitsablauf der Peptidtrennung
Nach der Analyse des Rohpeptids wird eine geometrische Skalierung auf eine große Säule mit denselben chemischen Eigenschaften für die Trennung vorgenommen. Die Skalierungsgleichungen in Abbildung 2 zeigen die Beziehungen zwischen Säulendurchmesser, Säulenlänge, Massenbeladung und Flussrate für die Übertragung einer Trennung von einer Säulengröße auf eine andere. Die Angabe der Gradientensteigung als prozentuale Änderung pro Säulenvolumen anstelle der prozentualen Änderung pro Zeiteinheit hilft sicherzustellen, dass die Auflösung erhalten bleibt, indem für jeden Schritt der Gradientenmethode von den Anfangs- bis zu den Endbedingungen die gleiche Anzahl von Säulenvolumina bereitgestellt wird. Präparative Methoden müssen eine anfängliche Haltezeit bei den Startbedingungen beinhalten, um die Systemverzögerung nachzuahmen, die auch in der Anzahl der Säulenvolumina ausgedrückt wird und bei der Trennung im kleinen Maßstab beobachtet wird. Nach Abschluss der präparativen Chromatographie werden die gesammelten Fraktionen analytisch ausgewertet. Das reine Peptid wird anschließend gemäß den Benutzungsrichtlinien prozessiert.
Abbildung 2. Skalierungsgleichungen
Die einfachsten Flüssigkeitschromatographiesysteme, die mit einer Pumpe, einem Injektor, einem UV-Detektor und einem Fraktionssammler konfiguriert sind, sind perfekt für die Peptidtrennung geeignet (Abbildung 3). Die Massendetektion ist für die Peptidisolierung nicht erforderlich, identifiziert aber das Peptidziel und verringert die Anzahl der gesammelten Fraktionen, die nach der Isolierung analysiert werden müssen. Verbindungen, die nicht oder schlecht ionisieren, werden oft mit UV-Strahlung niedriger Wellenlänge detektiert. Umgekehrt lassen sich Peptide mit sehr geringer UV-Extinktion in der Regel problemlos mit MS nachweisen.
Abbildung 3. Diagramm des grundlegenden Flüssigkeitschromatographiesystems
Anmerkungen zum Aufreinigungsprozess
Trennmethoden
Da die Eigenschaften der verschiedenen Peptide so unterschiedlich sind, variieren auch die chromatographischen Trennmethoden. Während die Umkehrphasenchromatographie bei weitem das gängigste Verfahren zur Peptidaufreinigung ist, werden einige Peptide mithilfe alternativer Selektivitäten wie Ionenaustausch oder Größenausschluss effizienter isoliert. Diese alternativen Techniken können auch mit Umkehrphasen kombiniert werden, wodurch ein zweistufiger Prozess für schwierige Proben erstellt wird.
Umkehrphase (Reversed-Phase)
Wegen ihrer Reproduzierbarkeit und breiten Anwendbarkeit wird die Umkehrphasenchromatographie üblicherweise zur Trennung vieler Arten von Verbindungen, einschließlich Peptiden, verwendet. C18-gebundenes Silika, eiine der gängigsten Arten von Umkehrphasen für Säulenpackungen, ist unpolar. Die Umkehrphase mit mobilen Phasen, die normalerweise aus Wasser mit einem mischbaren polaren organischen Lösungsmittel wie Acetonitril oder Methanol besteht, eluiert Verbindungen von C18-Säulen basierend auf ihrer Polarität. Je hydrophober ein Peptid daher ist, desto mehr wird es auf einer C18 -Säule retenieren.
Obwohl C18 die gängigste Umkehrphasenpackung ist, können auch andere Liganden (C4, C8, RP18, Phenyl usw.) an das Basispartikel gebunden werden, um eine alternative Selektivität für die optimierte Trennung von Verbindungen bereitzustellen. Silika war zwar eines der ersten Substrate, das für Umkehrphasenpackungen verwendet wurde, aber Packungsmaterialien auf Silika-Basis setzen der Trenngeschwindigkeit, der Auflösung, dem pH-Wert, der Temperatur und der Beladbarkeit der Säule Grenzen. Die patentierte* Hybridpartikeltechnologie, die bei der Entwicklung neuer Säulensubstrate verwendet wird, erzeugt Partikel, die bei höheren Geschwindigkeiten, Temperaturen und pH-Werten betrieben werden können, während Selektivität, Auflösung, Reproduzierbarkeit und Säulenlebensdauer verbessert werden.
*US-Patent-Nummer 6,686,035 B2
Ionenaustausch
Die Ionenaustauschchromatographie wird seit langem zur Trennung von Proteinen und anderen Biologika eingesetzt. Da die Aminosäuren in einem Peptid entweder positiv oder negativ geladen sein können, kann die Ionenaustauschchromatographie zur Peptidtrennung verwendet werden. Funktionalisierte natürliche Polymerharze wie Agarose, synthetische Polymere wie Poly(methylmethacrylat) (MMA) oder Polystyrol-Divinylbenzol werden üblicherweise als Medien für Trennungen großer Moleküle verwendet, da diese Materialien den strengen Reinigungsanforderungen standhalten, die zwischen Prozesszyklen und Batches in der Bioprozessierung im großen Maßstab auftreten müssen. Natriumhydroxidlösungen, die bei diesem Verfahren verwendet werden, sind schädlich für Materialien auf Silikabasis, die üblicherweise für Trennungen kleiner Moleküle und kleiner Peptide verwendet werden.
Es gibt vier Arten von Ionenaustauschern: schwache Anionen, schwache Kationen, starke Anionen und starke Kationen. Ein Kationenaustausch dient dazu, positiv geladene Ionen an einer negativen Oberfläche zu retenieren und zu trennen, während ein Anionenaustausch dazu dient, negativ geladene Ionen an einer positiven Oberfläche zu retenieren und zu trennen. Starke Anionen- und Kationenaustauscher-Säulen werden über einen weiten pH-Bereich (2 – 12) vollständig ionisiert, während schwache Ionenaustauscher-Säulen über einen schmalen pH-Bereich (9,5 - 5,5) geladen werden.
Die Isolierung von Peptiden durch Kationenaustausch ist häufiger als durch Anionenaustausch, aber die bevorzugte Methode hängt von der Peptidsequenz ab. Bei Peptidtrennungen, die bei einem pH-Wert unter 3 durchgeführt werden, werden die negativen Ladungen der Carboxylgruppen der Aminosäure-Seitenketten neutralisiert und die N-terminalen Gruppen protoniert, wodurch die Peptide positiv geladen und von den negativen Stellen der Kationenaustauschersäule angezogen werden (Abbildung 4).
Abbildung 4. Wechselwirkung von Peptiden und Kationenaustauscher-Säulenpackung
Umgekehrt kann bei Peptiden, die für eine Trennung zwischen einem pH-Wert von 6 und 10 geeigneter sind, ein Anionenaustauscher verwendet werden. Beim Anionenaustauscher sind die Carboxylgruppen des Peptids negativ geladen und wechselwirken bei einem höheren pH-Wert mit den positiven Stellen der Anionenaustauschersäule (Abbildung 5).
Abbildung 5. Anziehung von Peptiden zur Anionenaustauscher-Säulenpackung
Für die Auswahl einer Säule und die Entwicklung einer Methode zur Peptidtrennung mittels Ionenaustausch können wir Ihnen einige allgemeine Empfehlungen geben. Es kann entweder ein Anionen- oder Kationenaustauscher verwendet werden. Als allgemeiner Ausgangspunkt werden saure Peptide beim Anionenaustausch und basische Peptide beim Kationenaustausch getrennt. Diese Auswahl kann bei einigen Peptiden, insbesondere bei größeren, umgekehrt werden. Der pH-Wert muss jedoch so angepasst werden, dass die Nettoladung das Gegenteil des Packungsmaterials ist.
Für beide Polaritäten werden starke Austauscher für die Peptidchromatographie bevorzugt. Die Ladung eines Peptids ist eine Funktion der Sequenz und der Mikroumgebung um die geladenen Seitenketten. Durch kleine Anpassungen des pH-Werts der mobilen Phase kann die Trennselektivität basierend auf der spezifischen Peptidsequenz eingestellt werden. Diese kleinen Einstellungen der Selektivität beeinflussen die Bindungskapazität des starken Ionenaustauschers nicht.
Die Auswahl der mobilen Phase und der Betriebsbedingungen wird davon beeinflusst, ob die Ionenaustauschertrennung der erste Schritt einer zweistufigen Aufreinigung sein soll oder ob sie der einzige Trennschritt sein soll, der Versuchsmaterial liefert. Wenn das beim Ionenaustausch gesammelte Material mit Umkehrphasen weiter gereinigt werden soll, können die Puffer und Elutionsbedingungen den üblichen Praktiken für den Proteinionenaustausch folgen, z. B. durch Verwendung von Phosphat- oder Tris-Puffer und Elution mit einem Natriumchlorid-Gradienten. Die Salze werden im nächsten Schritt aus dem Produkt entfernt.
Wenn ein Ionenaustauscher gewählt wird, um verwendbare Peptide in einem einzigen Schritt herzustellen, ist es ratsam, flüchtige Puffer zu wählen, die durch Lyophilisierung entfernt werden können. Ammoniumformiat ist eine gute erste Option, da es zwei Pufferregionen hat, die den pK-Werten von Ammonium und Formiat entsprechen. Es kann von pH 3 bis pH 4 für die Kationenaustauschchromatographie basischer Peptide oder von den pH-Werten 9,25 - 10,25 für die Anionenaustauschchromatographie saurer Peptide verwendet werden. Die Elution kann mit einem Ionenstärkegradienten mit ansteigender Konzentration an Ammoniumformiat bei konstantem pH-Wert durchgeführt werden. Alternativ reduziert die Elution mit einem pH-Gradienten die zeitaufwendige Lyophilisierung aus Puffern mit hoher Ionenstärke. Auch hier bieten Ammoniumformiatpuffer einen nützlichen Ausgangspunkt. Die Elution verläuft von einem hohen zu einem niedrigen pH-Wert für saure Peptide auf Anionenaustauschern und von einem niedrigen zu einem hohen pH-Wert für basische Peptide auf Kationenaustauschern.
Größenausschluss
Die chromatographische Trennung von Molekülen auf Basis der Größe, heute Größenausschluss-Chromatographie (SEC, Size-Exclusion Chromatography) genannt, geht bis in die 1950er-Jahre zurück. Die Trennung von Molekülen anhand der Größe statt anhand ihrer chemischen Eigenschaften wie Ladung oder Polarität ist seit jeher auch als Gelfiltration oder Gelpermeations-Chromatographie (GPC) bekannt. Partikel der stationären Phase mit einer definierten Porengrößenverteilung schließen Probenmoleküle aus, die größer als die Hohlräume im Säulenbett sind, wodurch sie sehr schnell eluieren, während kleine Moleküle in die Poren gelangen und anschließend einen gewundenen und langsameren Weg zur Elution nehmen. Daher eluieren große Moleküle zuerst, während kleinere Moleküle in abnehmender Reihenfolge ihrer Größe in der Lösung eluieren (Abbildung 6). SEC ist eine Technik mit niedriger Auflösung, die isokratische Methoden verwendet und keine Äquilibrierung zwischen den Läufen erfordert. Die Beladung der Säule hängt vom Probenvolumen und der Konzentration ab, die beide die Auflösung beeinflussen.
Abbildung 6. Probenelution mittels Größenausschluss-Chromatographie
SEC wird manchmal als erster Aufreinigungsschritt verwendet, um verkürzte Sequenzen, Peptide mit unvollständiger Entschützung und andere Verunreinigungen zu entfernen. Mit zunehmender Länge eines synthetischen Peptids kann die Anzahl dieser Verunreinigungen erheblich sein. Jeder einfache anfängliche Aufreinigungsschritt vor der Trennung durch Umkehrphasen verringert die chromatographische Komplexität. SEC kann auch für den Pufferaustausch verwendet werden, d. h. für den Austausch des Puffers, in dem das Peptid derzeit gelöst ist, gegen einen anderen Puffer oder eine Lösung, die für das nächste Experiment oder den nächsten Aufreinigungsschritt geeigneter ist.
Zusammenfassung
Peptide können mithilfe vieler verschiedener Chromatographietechniken analysiert und isoliert werden, einschließlich Umkehrphasen, Ionenaustausch und Größenausschluss. Im semipräparativen Maßstab (wenige Milligramm bis einige hundert Milligramm für die Trennung) wird in der Regel eine Umkehrphasen-Methode angewandt. Der Rest dieser Diskussion über die Peptidtrennung wird den Faktoren und Techniken gewidmet sein, die zur Optimierung der Peptidanalyse und -aufreinigung mithilfe von Umkehrphasenchromatographie verwendet werden können.
In diesem Leitfaden
Praktische Ansätze zur Peptidtrennung
Anmerkungen zur Methodenentwicklung
