Umfassender Leitfaden zur Hydrolyse und Analyse von Aminosäuren

Auch wenn sich dieses Handbuch im Allgemeinen auf die ersten Schritte der Aminosäureanalyse konzentriert – wobei der Schwerpunkt auf der Probenvorbereitung für die Hydrolyse liegt – wird in diesem Abschnitt kurz auf die gebräuchlicheren Quantifizierungsmethoden bei der Aminosäureanalyse eingegangen. In diesen Beispielen liegen die Ergebnisse der Aminosäureanalyse vor; die ursprüngliche Probenkonzentration muss berechnet werden. Bei diesen Beispielen wird davon ausgegangen, dass AccQ•Tag oder AccQ•Fluor Reagenzien für die Derivatisierung verwendet wurden.

Bevor Sie mit der Quantifizierung beginnen:

• Überprüfen Sie, ob alle Peaks korrekt identifiziert wurden.
• Wenn die Retentionszeiten nicht übereinstimmen, überprüfen Sie die Werte in Ihrer Kalibriertabelle.
• Überprüfen Sie die korrekte Integration aller Peaks.

Das Ziel einiger Analysen besteht lediglich darin, die Konzentration der analysierten Probe zu bestimmen. Diese Ergebnisse werden normalerweise in molaren Konzentrationen wie µmol/L ausgedrückt. Die chromatographischen Ergebnisse werden typischerweise in Picomol angegeben. Zur Konzentrationsbestimmung werden die von der Chromatographiesoftware gemeldeten Picomol der Aminosäuren durch das Injektionsvolumen dividiert. Dieser Wert wird dann mit dem Volumen des Verdünnungsmittels geteilt durch das derivatisierte Volumen multipliziert. Um die Berechnung abzuschließen, multiplizieren Sie mit dem Verdünnungsfaktor und wandeln die Einheiten dann in µmol pro Liter um.

Beispielrechnung:
Um die Konzentration der Aminosäure in der Originalprobe auf Basis des ermittelten Wertes zu bestimmen, verwenden wir die folgende Gleichung:

Dabei gilt:

pmol AA = berichtete Menge an Aminosäuren in der Probe Vi = Injektionsvolumen in µL, typischerweise 1 µL

Vd = derivatisiertes Volumen in µL, typischerweise 10 µL

Vr = Volumen des zur Rekonstitution der Probe verwendeten Verdünnungsmittels in µL Dil. Factor = Verdünnungsfaktor

Beispiel:

Eine anfängliche 100-µL-Probe der hydrolysierten Proteinprobe wurde 1:1 mit internem Standard verdünnt. Ein 10-µL-Aliquot wurde derivatisiert. Das Injektionsvolumen betrug 1 µI und der berichtete Wert betrug 312,5 pmol für Asparagin (Asn).

Die Asn-Konzentration in µmol/L wäre:

Die Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung eines hydrolysierten Proteins beinhaltet die Berechnung der Molverhältnisse der Komponenten in einer Probe.

Jedes reine Protein hat eine spezifische stöchiometrische Anzahl von Resten für jede enthaltene Aminosäure. Idealerweise liefern die Ergebnisse einer Analyse ganzzahlige Molverhältnisse. Inwieweit sich die beobachteten Werte diesem Ideal nähern, hängt von der Reinheit des Proteins oder Peptids, der Eignung der Hydrolysebedingungen und der Qualität der Aminosäureanalyse ab.

Beispiel 1 (wie in der folgenden Tabelle wiedergegeben):

1. Tragen Sie die beobachteten Picomol für jede Aminosäure in eine Tabelle ein (durch Analyse ermittelt).
2. Schätzen Sie die Anzahl der Reste (geschätzte Zusammensetzung) für jede Aminosäure durch Überprüfung. Hinweis: Die beobachteten Reste sind die relative molare Konzentration jeder Aminosäure. Dividieren Sie alle beobachteten Picomol durch die Aminosäure mit der kleinsten Fraktion und runden Sie diese auf die nächste Ziffer.
3. Summieren Sie die Picomol und die Anzahl der Reste für alle Aminosäuren.
4. Berechnen Sie den durchschnittlichen pmol/Rest, indem Sie die Summe der beobachteten Picomol durch die Summe der geschätzten Zusammensetzung dividieren.
5. Dividieren Sie alle beobachteten Picomol durch den Wert von Picomol/Rest, um die beobachtete Zusammensetzung zu bestimmen.

WARNUNG: Bei größeren Proteinen ist die Schätzung der Anzahl der Reste aufgrund der erforderlichen höheren Präzision schwieriger.

WARNUNG: Die Wiederfindung einiger Aminosäuren aus der Hydrolyse kann variabel sein (Ser, Tor, Tyr und Met werden abgebaut; Val- und Ile-Bindungen können schwierig zu spalten sein).

Hinweis: Um die Quantifizierung in diesen Fällen zu verbessern, wird empfohlen, eine Zeitablaufstudie durchzuführen. Typischerweise werden Proben 24, 48 und 72 (oder 96) Stunden lang hydrolysiert; Werte für labile Aminosäuren werden durch Extrapolation auf den Zeitpunkt Null bestimmt, während die Werte für Ile und Val aus der längsten Hydrolyse entnommen werden.

Beispiel 2:
Wie bereits erwähnt kann die Berechnung des Molprozentsatzes (der Anzahl der Reste jeder Aminosäure pro 100 Proteinreste) in einigen Fällen zufriedenstellend sein. Dieser wird wie folgt ermittelt:

Wenn eine Abschätzung des Molekulargewichts des Proteins verfügbar ist, können zwei Ansätze verwendet werden, um eine ungefähre Zusammensetzung zu berechnen:

1. Schätzen Sie das Molekulargewicht der Probe (MW).
2. Summieren Sie die Gesamtausbeute an Aminosäuren in Picomol.
3. Dividieren Sie das Molekulargewicht durch 110, das durchschnittliche Molekulargewicht der Aminosäuren. Hinweis: So erhalten Sie eine gute Näherung der Gesamtkettenlänge oder der gesamten Aminosäuren.
4. Dividieren Sie die Gesamtausbeute durch die Kettenlänge (entspricht der Molmenge der injizierten Probe).
5. Dividieren Sie für jede Aminosäure die Menge durch die injizierte Molmenge (entspricht der Anzahl der Rückstände pro Mol). Untersuchen Sie die Abweichungen von den ganzzahligen Beträgen.
6. Variieren Sie den Divisor (injizierte Molmenge) leicht nach oben oder unten, um die Abweichung von den ganzzahligen Beträgen (ermittelt in Schritt 5) zu minimieren. Dieser Schritt kann mit einem Tabellenkalkulationsprogramm oder einer speziellen Aminosäuresoftware, die die minimalen Abweichungen erkennt, vereinfacht werden.
7. Beachten Sie, dass die Werte für labile Aminosäuren und stabile Bindungsbildner aufgrund schlechter Ausbeuten bei der Hydrolyse erheblich von den ganzzahligen Beträgen abweichen können.

Dieses alternative Verfahren erfordert mehr Kenntnisse über die Probe.

1. Wählen Sie in der Analyse eine Aminosäure aus, die die folgenden zwei Kriterien erfüllt:
   • Ergibt gute Ausbeuten bei Hydrolyse und Derivatisierung (z. B. Asp, Glu, His, Arg, Ala, Pro, Leu, Phe, Lys). Gly ist möglicherweise keine gute Wahl, da es eine häufige Hintergrundverunreinigung ist; und
   • nur wenige Rückstände pro Mol der Probe aufweist (basierend auf dem geschätzten Molekulargewicht der Probe und der Aminosäureausbeute). Diese Informationen können durch andere Verfahren ermittelt werden, z. B. durch den Bromcyan-Verdau, der die intakte Polypeptidkette selektiv an Methionin spaltet.
2. Wählen Sie basierend auf diesen Informationen einen ganzzahligen Wert für diese Aminosäure aus.
3. Dividieren Sie die Ausbeute der ausgewählten Aminosäure durch den ausgewählten ganzzahligen Wert, um die geschätzte Molmenge der injizierten Probe zu ermitteln.
4. Befolgen Sie die Schritte 5 und 6 von Abschnitt 7.3.2.1.
5. Überprüfen Sie die Werte (einmal größer und einmal kleiner als der gewählte ganzzahlige Wert), um zu sehen, ob kleinere Abweichungen von den ganzen Zahlen erhalten werden.

Die Peptid- oder Proteinkonzentration in der Originalprobe kann aus der Summe der Produkte der Anzahl von Picomol jeder Aminosäure, multipliziert mit ihrem entsprechenden Molekulargewicht, berechnet werden.

Anhand des in der Tabelle aus Abschnitt 7.3.1 angeführten Beispiels beginnt die Berechnung wie folgt:

Beispielrechnung:

Für Asp (Asparagin) in der Probe: 220 Picomol, beobachtet bei einem Molekulargewicht der Aminosäure von 133,10 g/mol, ergibt Folgendes:

Dieselbe Berechnung wird für jede gewünschte Aminosäure durchgeführt. Die folgende Tabelle zeigt die berechneten Pikogramme für jede Aminosäure, wobei die Gesamtsumme der Pikogramme des aus der Probe injizierten Proteins unten rechts angegeben ist.

Bei der Analyse von Lebens- und Futtermitteln gelten ebenfalls die oben angegebenen berechneten Werte. Die wichtigere Information für die meisten Futtermittelanalysen ist jedoch der Gehalt an spezifischen, wachstumsbeschränkenden Aminosäuren, z. B. Methionin und Cystein. Der Wert, der am häufigsten von Interesse ist, ist der prozentuale Gewichtsanteil der Aminosäuren in der Probe.

So berechnen Sie den Gewichtsprozentsatz einer Aminosäure:

Beispielrechnung:

Der angegebene Wert für die Menge (pmol/µL) muss mit dem Molekulargewicht des Rests (gm/mol) und etwaigen Umrechnungsfaktoren multipliziert werden.

Die angegebene Menge in g/mol wird dann mit etwaigen Verdünnungsfaktoren multipliziert. Das Ergebnis wird anschließend durch das Gewicht der Probe dividiert und mit 100 multipliziert, um es in einen Prozentwert umzurechnen.

Beispielrechnung:

Dabei gilt:

    Menge = Menge der Aminosäure in g/mL

    Verdünnung = Verdünnung der Probe

Probengewicht = Gewicht in mg

Diese Methode erfordert die Verwendung eines internen Standards.

Beispielrechnung:

Die Peakfläche des internen Standards wird mit dem Gewicht der Aminosäure in mg multipliziert. Dieser wird anschließend durch das Ergebnis der Multiplikation der Peakfläche der Aminosäure mit dem Gewicht des internen Standards dividiert.

Dabei gilt:

    RF_aa = Response-Faktor für die Aminosäure

    P_n = Peakfläche für internen Standard

    P_aa = Peakfläche für die Aminosäure in der Probe

    W_aa = Gewicht der Aminosäure in mg

    W_n = Gewicht des internen Standards in mg

Die Berechnung des prozentualen Gehalts beginnt mit der Multiplikation der Peakfläche der Aminosäure mit dem berechneten Response-Faktor. Dieser wird dann mit dem internen Standardfaktor multipliziert. Diese Zahl wird dann durch das Produkt aus der Peakfläche des internen Standards und dem Gewicht der analysierten Probe dividiert. Dieser wird dann in einen Prozentwert umgewandelt.

Dabei gilt:

    P_aa = Peakfläche der Aminosäure

    P_n = Peakfläche des internen Standards

    RF_aa = Berechneter Response-Faktor

    IS = IS = Berechneter interner Standardfaktor

Beispiel:

Für eine Aminosäure in einer Futtermittelprobe wurden folgende Werte ermittelt:

    Gewicht der Aminosäure (W_aa) = 0,5 mg

    Peakfläche der Aminosäure (P_aa) = 100.000

    Peakfläche des internen Standards (P_n) = 110.000

    Gewicht des internen Standards (W_n) = 0,5 mg

    Gewicht der Testportion (W_s) = 10 mg

0,5 mg x 2 x 10-2 = 0,05

Die betreffende Aminosäure ist in einer Menge von 0,9 Gew.-% des Futtermittels vorhanden.