Umfassender Leitfaden zur Hydrolyse und Analyse von Aminosäuren

Der Begriff „Protein und Peptid“ bezieht sich auf eine relativ reine Probe aus einem Bioreaktor oder Reinigungsprozess. Diese Proben enthalten wenig oder keine zusätzlichen Nicht-Proteinmaterialien. Die Gewinnung freier Aminosäuren aus einem intakten Protein oder Peptid ist ein entscheidender Schritt bei der Erstellung nützlicher, genauer Analysedaten. Um dies zu ermöglichen, ist es notwendig, ein Protein/Peptid in seine einzelnen Aminosäurebestandteile abzubauen oder zu hydrolysieren.

In diesem Abschnitt werden die grundlegenden Verfahren für die Dampfphasen- und Flüssigphasen-Hydrolyse von Proteinen und Peptiden vorgestellt, wobei die für eine optimale Analyse erforderlichen Vorüberlegungen im Vordergrund stehen.

Weitere Unterabschnitte befassen sich mit alternativen Hydrolyseverfahren für die Analyse spezieller Proben, die Aminosäuren enthalten, die mit den Standard-Säurehydrolyseverfahren (HCl) nicht kompatibel sind: Tryptophan und Cystein/Cystin.

In diesem Abschnitt konzentrieren wir uns auf die Säurehydrolyse mit HCl, die am häufigsten verwendete Methode zur Vorbereitung von Aminosäureproben. Damit Proteinproben jedoch vollständig hydrolysiert werden können (egal mit welcher Methode), müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Die neutralisierenden Puffer sowie eventuell vorhandene Feststoffe sollten bei den Verfahrensbeurteilung berücksichtigt werden. Außerdem variiert die Geschwindigkeit bzw. die Länge der Hydrolyse je nach den in den Proteinen vorhandenen Aminosäuren, was zeitliche Verlaufsstudien des Hydrolyseprozesses und eine angemessene Validierung der Gesamtmethoden erforderlich macht. Die ordnungsgemäße Handhabung der Proben während der Hydrolyse gewährleistet hochwertige Ergebnisse. Die häufigsten Schwierigkeiten bei dieser Art von Analyse sind in der Regel auf eine unsachgemäße oder nachlässige Technik zurückzuführen. Für eine effektive Hydrolyse mit dieser Methode müssen zunächst vier Fragen beantwortet werden:

1. Ist eine Probenverdünnung erforderlich?
2. Welches Probenvolumen muss in die Hydrolyseröhrchen abgegeben werden?
3. Welches spezifische Säurevolumen muss in die Röhrchen gegeben werden (nur Flüssighydrolyse)?
4. Wie hoch ist die Menge des internen Standards, wenn er in dieser Phase verwendet wird?

In den folgenden Abschnitten werden die erforderlichen Bestimmungen erläutert und gegebenenfalls Beispielrechnungen aufgeführt.

2.1.1 Vorüberlegungen

Sofern die Probe nicht begrenzt ist, sollten zwischen 2 und 25 µg Protein in der Hydrolyse vorhanden sein, um die Auswirkungen einer Kontamination zu minimieren. Unabhängig vom Hydrolysemodus werden 20 µg empfohlen.

• Es sollte kein Überschuss an festem Material in der Probe vorhanden sein. Dieses Material kann die Dampfphasenhydrolyse stören.
• Wenn andere Feststoffe in der Probe zusammen mit dem Protein vorhanden sind, sollten diese Gewichte bei der Konzentration der Feststoffe pro Säurevolumen zum Protein addiert werden.
• Die Nettokonzentration der Säure bei der Hydrolyse sollte ca. 6 N betragen.
• Die Verwendung eines internen Standards (z. B. Nva [Norvalin]) wird gegenüber externen Standards empfohlen.
• Der interne Standard sollte vor der Hydrolyse zugesetzt werden. Er kann gegebenenfalls während der Probenvorbereitung zugegeben werden oder zu der Säure, die dann in die Hydrolyseröhrchen gegeben wird. Normalerweise wird die Menge des internen Standards so berechnet, dass sie der für die Kalibrierung verwendeten Standardmenge entspricht.
• Der Säure, die für die Hydrolyse verwendet wird, wird Phenol zugesetzt, das als Sauerstofffänger wirkt. Verdünnungsverhältnis auf 20 µg Ziel.

2.1.2 Verdünnung der Probe (falls erforderlich) vor der Flüssighydrolyse

• Fügen Sie mindestens 10 µL der Probe (verdünnt oder unverdünnt) in das Hydrolyseröhrchen hinzu. Alles, was darunter liegt, führt aufgrund der volumetrischen Unsicherheit zu einer inakzeptablen Fehlerquote.
• Bei der Hydrolyse muss außerdem ein Gewichtsüberschuss an Säure vom 10- bis 100-fachen des Probengewichts vorliegen. Bei einer übermäßig konzentrierten Probe funktioniert die Hydrolyse möglicherweise nicht effektiv. In diesen Fällen muss die Probe verdünnt werden. Stellen Sie sicher, dass bei der Flüssigkeitshydrolyse ein ca. 100-facher Gewichtsüberschuss der Säure gegenüber Feststoffen vorliegt.
• Stellen Sie sicher, dass ein 25-fach molarer Säureüberschuss gegenüber den Puffern in der Probe vorliegt. Multiplizieren Sie die Mol des Phosphatpuffers mit 3, um die drei titrierbaren Gruppen zu berücksichtigen.
• Das Gesamtvolumen für die Hydrolyse darf 50 % der Gesamtkapazität des Hydrolyseröhrchens oder -behälters nicht überschreiten. Für 6 x 50 mm-Röhrchen beträgt das empfohlene Maximalvolumen 100 µL. Beziehen Sie die Volumina der Säure und des internen Standards in dieses endgültige Gesamtvolumen ein.

Beispielrechnung: Bestimmung der Verdünnungsanforderung

Für ein Protein, das 5 mg/mL in 150 mM NaCl enthält, werden die Menge der Feststoffe (einschließlich Salzen) und der Verdünnungsfaktor bestimmt.

Im ersten Schritt wird der Gesamtfeststoffgehalt der Probe bestimmt. Dazu multiplizieren Sie die Proteinkonzentration (µg/µL) mit der Gewichtskonzentration des Salzes (Konzentration x MW), um den Gesamtfeststoffgehalt zu erhalten.

Der nächste Schritt besteht darin, die Verdünnung zu bestimmen, die für das Ziel von 20 µg Protein (in 20 µL) erforderlich ist. Dazu multiplizieren Sie die gewünschte Menge bzw. das gewünschte Volumen mit der inversen Konzentration der Probe. Dies führt zu einem Verdünnungsverhältnis von 1:5, das für die oben beschriebene Probe benötigt wird.

2.1.3 In das Hydrolyseröhrchen abzugebendes Probenvolumen

Das empfohlene Gesamtvolumen für eine Hydrolyse beträgt 100 µL (bei Verwendung von 6 x 50-mm-Röhrchen), wobei das Volumen der Probe zwischen 10 und 20 µL liegt. Dieses Volumen der Probe, ob verdünnt oder unverdünnt, hängt von der Art der durchgeführten Hydrolyse ab und folgt diesen Richtlinien:

• Dampfphasenhydrolyse: Trocknen Sie die Probe unter Vakuum als dünnen Film auf dem Boden des Hydrolyseröhrchens.
• Flüssighydrolyse: Geben Sie entweder das entsprechende Volumen hinzu, um mindestens 2 µg Protein im Hydrolyseröhrchen zu hydrolysieren, oder stellen Sie eine größere Menge der Probe (bis zu 25 µg Protein) mit ausreichend 0,1 N HCl wieder her, um ungefähr 0,2 µg Protein (idealerweise in 10 µL) in die Hydrolyse zu überführen.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Analyse umso anfälliger für Kontaminationen ist, je geringer die Proteinmenge im Probenaliquot ist.

2.1.4 Säurevolumen für die Zugabe zur Hydrolyse

Das Volumen der zur Hydrolyse hinzugefügten Säure ist entscheidend. Dies gilt insbesondere für die Flüssigphasenhydrolyse. Richtlinien für das Säurevolumen mit einem ausführlichen Beispiel sind unten aufgeführt.

• Dampfphasenhydrolyse:
  • Fügen Sie 200 µL von 6 N HCl mit 0,1 bis 0,5 % Phenol auf den Boden des Hydrolysebehälters hinzu. (Wenn Sie eine kommerzielle Hydrolyse-Workstation verwenden, fügen Sie das vom Hersteller empfohlene Volumen hinzu. Weitere Informationen finden Sie in den Abschnitten 4 und 5.)
• Flüssigphasenhydrolyse (siehe Beispiel unten):
  • Vergewissern Sie sich, dass die endgültige Säurekonzentration 6 N beträgt (mit dem zugegebenen Phenol).
  • Stellen Sie sicher, dass der molare Säureüberschuss ausreicht (~25-fach), um die Puffer zu neutralisieren.
  • Stellen Sie sicher, dass der Säureüberschuss im Verhältnis zum Gesamtfeststoffgehalt ausreicht (~100-fach). Berücksichtigen Sie die Probenmatrix und andere Feststoffe zusammen mit dem Protein in dieser Schätzung.

Beispielrechnung: Bestimmung des Säurevolumens, das einer Flüssighydrolyse hinzugefügt werden muss

Gemäß den obigen Richtlinien muss die Säuremindestmenge, die für eine Hydrolyse hinzugefügt wird, das 25-fache der Pufferkonzentration und das 100-fache des Gewichtsüberschusses der Probe überschreiten. Zur Bestimmung des benötigten Säurevolumens müssen Sie daher Folgendes berechnen:

1. Die vorhandene Puffermenge
2. Die Säuremenge, die für die Neutralisation (25-fach) des Puffers in der Probe erforderlich ist
3. Die Säuremenge in Volumen umrechnen
4. Den Gesamtfeststoffgehalt in der Probe
5. Die minimale Säuremenge, die erforderlich ist, um den angestrebten Säureüberschuss über der Probe bereitzustellen (100-fach)
6. Die Säuremenge in Volumen umrechnen
7. Erforderliche Gesamtsäuremenge (Summe aus Neutralisation und Überschuss)

Für ein Protein mit 2,1 mg/mL in 2 mM Na/K₂PO₄:

Die Puffermenge in jedem Röhrchen wird bestimmt, indem die molare Konzentration des Puffers mit der Anzahl der titrierbaren Gruppen (drei für den Phosphatpuffer) multipliziert und dann an das Gesamtvolumen der abgegebenen Probe angepasst wird – in diesem Fall 10 µL.

Jedes Röhrchen enthält 60 nmol Puffer.

Als nächstes wird der 25-fache Überschuss bestimmt, indem der Betrag mit 25 multipliziert wird.

Diese Zahl gibt die Mole der Puffersäure an, die für eine effektive Neutralisation erforderlich sind.

Die Mole der Puffer, die für die Neutralisierung benötigt werden, müssen dann in ein Säurevolumen umgerechnet werden, das in jedes Röhrchen gegeben wird.

Für diese Probe reicht ein Volumen von 0,25 µL aus, um den Puffer zu neutralisieren.

Um den 100-fachen Säureüberschuss gegenüber der Probe zu erreichen, muss die Gesamtmenge der Feststoffe in der Probe bestimmt werden. Die Gesamtfeststoffe sind das Protein plus Puffer plus alle anderen vorhandenen Materialien. In diesem Fall ist die Probe ein gereinigtes Protein.

Diese Bestimmung kann durch Multiplizieren der Proteinkonzentration (µg/µL) mit der Gewichtskonzentration des Salzes (Konzentration x MW) erfolgen, um den Gesamtfeststoffgehalt zu erhalten.

Der Gesamtfeststoffgehalt dieser Probe beträgt 24,9 µg.

Um den 100-fachen Säureüberschuss zu bestimmen, multiplizieren Sie den Gesamtfeststoffgehalt mit 100.

Schließlich rechnen Sie den Gewichtsüberschuss in ein Volumen von 6 M HCl um, das Sie in jedes Röhrchen geben, indem Sie das Gewicht mit dem Molgewicht der Säure mit der Molarität der Säure multiplizieren.

In diesem Fall liefern 11,4 µL 6 M HCl einen 100-fachen Säureüberschuss gegenüber der Probe.

Das endgültige Volumen der Säure, das in jedes Röhrchen gegeben wird, ist die Summe der Volumina, die benötigt werden, um den Probenpuffer zu neutralisieren und den 100-fachen Überschuss bereitzustellen:

Für eine effektive Hydrolyse wird ein 11,65-µL-Volumen von 6 M HCl benötigt. Dieses Volumen kann auf ein Volumen aufgerundet werden, das genau übertragen werden kann.

2.1.5 Interner Standard (IS)

Die Verwendung eines internen Standards (IS) kompensiert am besten die variable Hydrolyse der einzelnen Aminosäuren der Probe. Norvalin (Nva) ist ein häufig verwendeter interner Standard.

Bei Verwendung eines internen Standards:

• Er kann in der Probe vorbereitet und abgegeben werden.
• Er kann getrennt von der Probe hinzugefügt werden.
• Er kann in der Säure vorbereitet und abgegeben werden.
• Stellen Sie sicher, dass Sie den internen Standard so vorbereiten, dass das Injektionsvolumen von 1 µL auf dem Gerät die gleiche Menge auf der Säule liefert wie die Probe.

Um die benötigte IS-Menge in der Ausgangsprobe zu bestimmen, erfolgt die Berechnung ausgehend von der gewünschten Menge an benötigtem IS in der Probe. Als Teil dieser Berechnung ist es wichtig, den Derivatisierungsschritt zu berücksichtigen.

Beispielrechnung: Bestimmung der Menge des internen Standards für eine Probe

Der Gesamt-IS wird bestimmt, indem man rückwärts arbeitet und die in der endgültigen Probe benötigte IS-Menge, den Verdünnungsfaktor der Derivatisierung und die rekonstituierte Probe im Hydrolyse-Röhrchen multipliziert. In diesem Beispiel werden 25 pmol des IS in der endgültigen derivatisierten Probe benötigt, wobei die Probe während der Derivatisierung 10x verdünnt wird und vor der Derivatisierung 5x verdünnt wird. Daraus ergibt sich:

Wir benötigen in unserer Hydrolyseprobe 1250 pmol des IS.

Anhand des MW (mg/mol) und der Umrechnung von µL in mL können wir sehen, dass wir 0,14 mg des IS zu jedem mL unserer Ausgangsprobe hinzufügen müssen.

2.1.6 Dampfphasensäurehydrolyse

Die Dampfphasenhydrolyse wird für relativ reine Protein- oder Peptidproben empfohlen, die wenig oder kein partikuläres Material enthalten. Dieser Ansatz gilt als der empfindlichste. Eine eigenständige, automatische Hydrolyse-Workstation wird für diese Art der Hydrolyse bevorzugt. Die Vakuumkontrolle, die Aufrechterhaltung der Temperatur, die Stickstoffspülungen und die Probentrocknung, die für das Verfahren erforderlich sind, werden am besten von einem automatisierten System wie der in Abschnitt 4 beschriebenen Eldex Hydrolyse-Workstation durchgeführt.

Reagenzien:

• 6 N HCl mit 1 Vol.-% Phenol
• Stickstoff (vorgereinigte Qualität)
• Trockeneis

Hinweis: Weitere Informationen zu den Reagenzien finden Sie im Benutzerhandbuch der Hydrolyse-Workstation.

Vorgehensweise (basierend auf der Verwendung einer automatisierten Workstation):

1. Trocknen Sie ein Aliquot, das 0,5 bis 20 µg Protein enthält, in einem Hydrolyseröhrchen (6 x 50 mm).
2. Geben Sie 200 µL konstant siedende HCl, die 0,5 % Phenol enthält, auf den Boden des Vakuumvials (siehe Tipp unten).
3. Verschließen Sie das Vial unter Vakuum nach drei abwechselnden Vakuum-Stickstoff-Spülschritten.
4. Hydrolysieren Sie 24 Stunden lang bei 112 bis 116 °C.
5. Kühlen Sie das Vial ab, entfernen Sie überschüssige HCl von der Außenseite der Röhrchen, indem Sie sie mit einem Labortuch abwischen, und trocknen Sie die Probe unter Vakuum.

Tipps:

• Verwenden Sie kristallines Phenol und geben Sie einen Kristall (≈ 0,5 mg) auf den Boden des Vials. Der Kristall ist sauberer und stabiler als flüssiges Phenol.
• Pipettieren Sie die Probe und den internen Standard vorsichtig auf den Boden der Röhrchen. Verwenden Sie eine Spritze, um die Genauigkeit zu erhöhen und die Abgabe zu erleichtern.
• Sie können die Röhrchen beschriften, indem Sie sie mit einer Feile oder einem Diamantstift einritzen.
• Achten Sie darauf, dass keine HCl-Tröpfchen in die Röhrchen gelangen. Halten Sie die Röhrchen im Vakuumvial aufrecht. Bei weniger als 10 bis 12 Röhrchen fügen Sie leere Röhrchen zur Unterstützung hinzu. Es kann hilfreich sein, das Vial während des Abkühlens leicht zu kippen.

Hinweis: Nach der Hydrolyse tritt häufig eine braune Farbe in HCl auf. Diese stammt aus dem Phenol. Ethanol oder Aceton eignen sich gut, um Verfärbungen von Vials und Verschlüssen zu entfernen.

VORSICHT: Hydrolyseprobleme sind möglicherweise schwer von Derivatisierungsproblemen zu unterscheiden.

2.1.7 Flüssigphasensäurehydrolyse

Bei komplexeren Proben kommt die Flüssigphasenhydrolyse zum Einsatz. In diesem Fall sind Partikel oder andere Fremdstoffe vorhanden, die den Dampfphasenprozess stören können. Dieser Ansatz gilt insgesamt als weniger empfindlich, kann aber bei sorgfältiger und präziser Ausführung gute Ergebnisse liefern.

• Für diese Methode benötigte Geräte und Reagenzien:
• Analysenwaage
• Ofen oder Heizblock, der die auf ±0,1 °C eingestellte Temperatur aufrechterhalten kann
• Vortex-Mischer
• Vollpipetten
• Einstellbare Mikropipetten
• Hydrolyseröhrchen mit Kappen, 6 x 50 mm empfohlen
• Stickstoffquelle zum Spülen
• 6 N HCl

Vorgehensweise:

Bevor Sie beginnen –

Wiegen Sie entweder Proben, die etwa 20 mg Protein entsprechen, auf 0,1 mg genau in einem Hydrolyseröhrchen ab oder übertragen Sie die verdünnte Proben in Röhrchen (wie in den Abschnitten 2.1.3 und 2.1.4 berechnet). Normalerweise ist ein Gesamtvolumen von 10 µL üblich. Mischen Sie.

1. Geben Sie genau das richtige Volumen an internem Standard, berechnet aus Abschnitt 2.1.5, in die Hydrolyseröhrchen. Mischen Sie.
2. Fügen Sie einen Überschuss an 6 N HCl (berechnet aus Abschnitt 2.1.4, Schritt 3) hinzu, mischen Sie und spülen Sie 30 Sekunden lang mit Stickstoff. Schließen Sie das Röhrchen sofort.
3. Geben Sie es für 24 Stunden bei 110 °C in den Ofen. (Diese Parameter sollten das Ergebnis einer Zeitablaufstudie für das untersuchte Protein und die untersuchten Aminosäuren sein.)
4. Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Ofen und lassen Sie sie auskühlen.
5. Die Probe ist nun bereit für den Derivatisierungsschritt.

2.1.8 Fehlerbehebung bei der Säurehydrolyse

Mehrere Aminosäuren werden durch eine falsche Hydrolyse beeinflusst. Zum Beispiel:

• Geringe Ausbeuten an Methionin (Met) und Tyrosin (Tyr) sind in der Regel für ein schlechtes Hydrolyseverfahren bezeichnend – entweder durch unreine HCl oder eine unzureichende Sauerstoffentnahme. Beides kann zur Bildung von Chlor und zur anschließenden Chlorierung des Tyr führen.
• Geringe Ausbeuten der hydrophoben Aminosäuren (Ile, Leu, Val und andere) können auf eine unvollständige Hydrolyse hindeuten, die durch eine niedrige Ofentemperatur, eine verkürzte Hydrolysezeit (insbesondere, wenn eine schnelle Hydrolyse bei hoher Temperatur verwendet wird) oder einen Verlust von HCl aufgrund einer Überevakuierung nach dem Spülen mit Stickstoff verursacht wird (dies kann ein probenspezifisches Problem sein; einige Sequenzen, wie z. B. lle-Val-Leu, sind extrem hydrolysebeständig). Überprüfen Sie, ob noch flüssige HCl im Vial sichtbar ist, bevor Sie es in den Ofen stellen. Zu viel HCl kann ebenfalls ein Problem sein, denn die Flüssigkeit kann in der Probe kondensieren und zu braunen Rückständen, dem Verlust von Tyr und Met und dem Auftreten von Streupeaks führen.
• Wenn keine Gasphasenhydrolyse-Workstation verwendet wird, stellen Sie sicher, dass die Hydrolyse richtig eingerichtet ist. Das gesamte Hydrolysevial muss vom Ofen umschlossen sein. Die Verwendung eines Heizblocks, der nur die untere Hälfte des Vials umschließt, führt zur Kondensation der flüssigen HCl an der Oberseite. Die Hydrolyse ist dann unwirksam. 

Die Analyse von Trp in Proteinen und Peptiden wird durch die Instabilität dieser Aminosäure unter normalen Hydrolysebedingungen mit 6 N HCl erschwert. Alternative Hydrolyseverfahren können verwendet werden, um intaktes Trp für die Analyse zu erzeugen:

• Sulfonsäurehydrolyse (z. B. Methansulfonsäure und p-Toluolsulfonsäure)
• Basenhydrolyse und Verwendung von Thiolreagenzien in HCl, wie B-Mercaptoethanol (BME) oder Thioglykolsäure

2.2.1 Methansulfonsäure-Hydrolyse (MSA) für die Tryptophananalyse

Das MSA-Reagenz muss direkt in die Probenröhrchen (6 x 50 mm) gegeben werden (Flüssigphasenhydrolyse), da die Säure nicht flüchtig ist. Die Zugabe von Methanol und die Neutralisierung nach der Hydrolyse liefern gute Ergebnisse für Tryptophan und stören nicht bei einem nachfolgenden Derivatisierungsprozess. Abbildung 2 veranschaulicht die Reaktion von MSA mit dem Protein.

Hinweis: Dieses Verfahren kann auch zur Bestimmung von Cys und Met verwendet werden. Es wandelt Cys in Cya und Met in Methioninsulfon um.

Hinweis: Tyr und Trp sind in dem für die Cys- und Met-Analyse traditionell verwendeten Perameisensäure-Oxidationsverfahren nicht stabil.

2.2.1.1 Geräte und Reagenzien

• 4 M MSA mit 0,2 % (w/v) Tryptamin HCl
• Ultrareines Wasser
• Methanol-Wasser-Triethylamin, 2:2:1
• Hydrolyseröhrchen 6 x 50 mm
• Vakuumtrockengerät
• Wasserbad oder Heizblock

2.2.1.2 Vorgehensweise

1. Geben Sie jeweils 20 µL von 4 M MSA mit 0,2 % (w/v) Tryptamin HCl zu jedem der 6 x 50-mm-Probenröhrchen, die getrocknete Proben enthalten.
2. Geben Sie 100 µL Wasser in das Reaktionsvial.
3. Verschließen Sie es zur Hydrolyse.
4. Hydrolysieren Sie es 20 bis 24 Stunden lang bei 110 °C.
5. Lassen Sie das Vial abkühlen, öffnen Sie es und geben Sie 22 µL von 4 M KOH (genug zur Neutralisation) in jedes Probenröhrchen.
6. Lassen Sie es unter Vakuum trocknen.
7. Die Probe ist zur Derivatisierung bereit.

Tipps:

Überprüfen Sie die Kontroll-Blindproben auf Interferenzen.

• Verwenden Sie frische, reine MSA.
• Es kann sein, dass ein Teil der Interferenzen, die gelegentlich Tyr oder Val verdecken, von dem Tryptamin verursacht wird, das als Zusatzstoff in der kommerziellen Säure verwendet wird. Die Verwendung von MSA ohne Additiv kann eine Lösung darstellen.
• Verwenden Sie frisches KOH (oder ersetzen Sie es durch NaOH, wenn es in Ihrem Labor sauberer ist). Testen Sie die Fähigkeit der Base, die Säure zu neutralisieren, an einer Probe. Fügen Sie ein Basenvolumen hinzu, das den Basenüberschuss auf ein Minimum beschränkt.
• Stellen Sie einen Trp-Standard von 2,5 µmol/mL in H2O her. Bewahren Sie ihn im Gefrierschrank auf. Mischen Sie den Trp-Standard 1:1 mit dem H-Standard zur Kalibrierung.

ACHTUNG:

• Es kann zu Interferenzen mit Tyr und Val kommen. Die Ursache ist unbekannt. (HCl ist für die Hydrolyse von Tyr vorzuziehen.)
• Niedrige Met-Ausbeuten sind eine Funktion der Hydrolysebedingungen.
• Die Ausbeuten an Trp und Met sind aufgrund des Hydrolyseprozesses und nicht aufgrund des Analyseverfahrens nicht linear. Wenn die hydrolysierte Menge verringert wird, sinken die Ausbeuten; bei Met ist das Ergebnis gravierender.
• Schlechte Reproduzierbarkeit der Arg-Ergebnisse – Ursache unbekannt.

2.2.2 Alkalische Hydrolyse für die Tryptophananalyse

Wenn die saure Hydrolyse von Tryptophan Stabilitätsprobleme verursacht, ist die Hydrolyse von Protein mithilfe einer Base eine weitere Alternative.

• NaOH
• Essigsäure
• Ultrareines Wasser
• Hydrolyseröhrchen 6 x 50 mm
• Vakuumtrockengerät
• Wasserbad oder Heizblock

1. Die Verwendung von Kunststoffröhrchen (z. B. Teflon) kann erforderlich sein, um die Bildung von Silikaten und anschließende Solubilisierungs- oder Derivatisierungsprobleme zu verhindern.
2. Geben Sie wie im obigen MSA-Verfahren 20 µL frisches 4 M NaOH direkt in das Hydrolyseröhrchen.
3. Verschließen Sie das Röhrchen und erhitzen Sie es 16 Stunden lang bei 112 °C.
4. Lassen Sie es abkühlen und neutralisieren Sie es mit überschüssiger Essigsäure.
5. Die Probe ist zur Derivatisierung bereit.
6. Führen Sie Blindproben durch, um den Kontaminationsgrad zu bestimmen.
7. Überprüfen Sie die Methode an Standards und bekannten Proben.

Die quantitative Bestimmung von Cystein (Cys) in Proteinproben wird durch die Instabilität dieser Aminosäure unter Standard-Säurehydrolysebedingungen erschwert. Leider sind im Gegensatz zu Trp alternative Säure- oder Basenhydrolysen nicht zufriedenstellend. Zwei gebräuchliche Verfahren für die Cys-Analyse beinhalten die Umwandlung des Cysteins in stabilere Derivative. Das erste Verfahren ist die Alkylierung der Sulfhydrylgruppe und das zweite eine Oxidation zur säurestabilen Sulfon-, Cystein- oder Cyanursäure (Cya).

WARNUNG: Eine weitere Komplikation bei der Cys-Analyse besteht darin, dass ein Großteil der Aminosäure als das Dimer, Cystin (Cys2), vorliegt, das vor der Alkylierung zu Cystein reduziert werden muss.

Es ist wichtig zu beachten, dass diese spezifischen Verfahren vor dem Standard-Säurehydrolyseschritt durchgeführt werden.

Performinsäure ist ein starkes oxidierendes Reagenz, das Cystein (Cys) und Cystin (Cys2) quantitativ in Cysteinsäure (Cya) umwandelt (Abbildung 4). In der Literatur finden sich zahlreiche Hinweise auf die Verwendung dieses Reagenzes unter einer Vielzahl von Bedingungen und Verfahren. Das folgende Verfahren basiert auf dem von Tarr, G.E., 1986.

Hinweis: Dieses Verfahren liefert die genauesten Ergebnisse für Cystein und Methionin.

• Vakuumtrockengerät
• 6 x 50-mm-Hydrolyseröhrchen mit Kappen
• Ultrareine Ameisensäure
• Ultrareines Wasserstoffperoxid
• Analysenwaage
• Mikropipetten

1. Trocknen Sie die Probe (0,1 – 10 µg Protein oder 50 – 2000 pmol Peptid) in einem Hydrolyseröhrchen (6 x 50 mm) unter Vakuum.
2. Mischen Sie 19 Volumina 97 %ige Ameisensäure mit 1 Volumen Wasserstoffperoxid; lassen Sie das Ganze eine Stunde lang abgedeckt bei 22 °C stehen.
3. Fügen Sie 10 µL dieses Reagenzes zur getrockneten Probe hinzu, lassen Sie sie 30 Minuten bei 22 °C stehen und trocknen Sie sie im Vakuum.
4. Hydrolysieren Sie mit dem Standardverfahren 6 M HCl (siehe Abschnitt 1.1).

Hinweis Tyr und Trp sind bei diesem Oxidationsverfahren nicht stabil.

Alkylierungsverfahren sind selektiver als die Oxidation von Perameisensäure und führen zu geringen oder keinen Veränderungen bei den anderen Aminosäuren. Dadurch sind sie besser für die Analyse des vollständigen Proteins sowie für andere Verfahren nach der Cys-Modifikation geeignet, wie z. B. Peptid-Mapping.

In dieser Methode wird die Alkylierung mit 4-Vinylpyridin dargestellt; das unten beschriebene allgemeine Verfahren kann auch für andere Alkylierungsmittel angepasst werden. Prinzipiell muss der Probe ein ausreichendes, reduzierendes Reagenz zugesetzt werden, um Cystin (Cys2) in Cystein (Cys) umzuwandeln. Darauf folgt die Zugabe eines überschüssigen Alkylierungsreagenzes zur reduzierten Probe (Abbildung 5).

• Vakuumtrockner, Stickstoffquellentrockner oder Lyophilisator
• Wiederverschließbare Vials
• Analysenwaage
• pH-Messgerät
• Mikropipetten
• Pyridylethylcystein (PEC) als Standard
• Guanidinium HCl (Gu-HCl)
• Dithiothreitol (DTT)
• 4-Vinylpyridin (4-VP)
• N-Ethylmorpholiniumacetat
• Ultrareine Essigsäure
• Aminosäurestandard (Ersatzteilnummer: WAT088122)

1. Fügen Sie Wasser zu 6,4 mL N-Ethylmorpholinium hinzu, um ein Volumen von 100 mL zu erreichen.
2. Titrieren Sie mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 8,3.

Das folgende Verfahren kann für 1 bis 1000 nmol Protein oder Peptid verwendet werden.

1. Geben Sie die Probe in ein verschließbares Vial; trocknen Sie sie unter Vakuum, trocknen Sie sie mit N₂ oder lyophilisieren Sie sie.
2. Lösen Sie Probe in 1 mL Puffer.
3. Fügen Sie 1 g Gu-HCl hinzu. Mischen Sie.
4. Fügen Sie 4 mg DDT hinzu. Mischen Sie.
5. Bedecken Sie die Probe mit N₂, verschließen Sie sie und inkubieren Sie sie 4 Stunden lang bei Raumtemperatur.
6. Fügen Sie 8 µL 4-VP hinzu, bedecken Sie sie mit N₂ und inkubieren Sie sie 4 bis 16 Stunden lang bei Raumtemperatur.
7. Geben Sie 3 mL Wasser hinzu.
8. Entsalzen Sie sie.
9. Die Probe kann jetzt säurehydrolysiert werden.

Hinweis: Das gesamte Reaktionsvolumen kann durch Reduzierung des Puffers auf 0,25 mL, von Gu-HCl auf 250 mg, von DTT auf 1 mg und von 4-VP auf 2 µL verringert werden. Dies ist ausreichend für bis zu 250 pmol Probe. Nach der Alkylierung verdünnen Sie die Probe mit 750 µL H₂0 und fahren fort.

1. Stellen Sie eine 2,5 mM Lösung von Pyridylethylcystein (PEC) her.
2. Fügen Sie 200 µL Aminosäurestandard zu 200 µL der Lösung hinzu.
3. Derivatisieren Sie 10 µL der kombinierten PEC-Kalibriermischung.
4. Rekonstituieren Sie in 100 µL; injizieren Sie 4 µL, um auf 250 pmol zu kalibrieren.

Hinweis: 8 µL 4-VP entsprechen ca. 74 µmol. Der Ersatz von 4-VP durch andere Alkylierungsreagenzien (z. B. Iodessigsäure) in dem Verfahren kann mit der gleichen Reagenzkonzentration erfolgen.