Leitfaden für Einsteiger in die Convergence-Chromatographie

In diesem Kapitel wird zuerst die in beiden CC verwendete Terminologie beschrieben. Anschließend wird beschrieben, welche Probentypen und Analyten für die Analyse durch das ACQUITY UPC² System in Frage kommen. Wir erläutern die Rolle von Hilfslösungsmitteln, Additiven für mobile Phasen und Probendiluenten sowie den Einfluss von Druck und Temperatur auf die Dichte und wie diese Trennungen beeinflussen. Schließlich führen wir ein generisches Protokoll zur Methodenentwicklung ein.

Terminologie

Wie bereits beschrieben, ähnelt die CC der RP-LC, ersetzt jedoch das schwache Lösungsmittel (mobile Phase A) durch komprimiertes CO₂ anstelle von Wasser. Herkömmliche Begriffe wie Lösungsmittel, Hilfslösungsmittel oder Modifikator beziehen sich alle auf die primäre(n) flüssige(n) Komponente(n) der mobilen Phase B, das starke eluierende Lösungsmittel. Typischerweise ist das Hilfslösungsmittel bei der CC zwar Methanol, doch können es auch andere organische Lösungsmittel wie Ethanol, Isopropylalkohol, Acetonitril oder Kombinationen davon sein. Ein Additiv ist ein Salz oder eine Flüssigkeit, die in niedriger Konzentration zum Hilfslösungsmittel hinzugefügt wird, um die Peakform und/oder die Löslichkeit des Analyten zu verbessern. Das Additiv kann auch die chromatographische Selektivität beeinflussen. Typische Additive sind Diethylamin, Ammoniumhydroxid, Ameisensäure, Trifluoressigsäure, Ammoniumformiat, Ammoniumacetat oder kleine Mengen Wasser. Die geeignete Konzentration ist vom Additiv abhängig; zum Beispiel birgt die Zugabe von Wasser über 5 % die Gefahr der Bildung einer zweiphasigen mobilen Phase, wenn die anderen Methodenbedingungen nicht entsprechend gewählt werden.

Eine der ersten Fragen, die bei jeder neuen Analysemethode gestellt werden, lautet: „Kann meine Probe mit dieser Technik analysiert werden (Convergence-Chromatographie)?“ Die einfachste Antwort lautet: Wenn die Probe in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden kann, kommt sie für die CC in Frage. Es gibt keine universelle Antwort auf diese Frage und es sind einige experimentelle Arbeiten erforderlich, um sie zu bestätigen. Diese Kompatibilität mit organischen Injektionslösungsmitteln ist sehr praktisch, da viele Techniken der Probenvorbereitung in organischen Lösungsmitteln durchgeführt werden (z. B. Flüssig-Flüssig-Extraktion, Festphasenextraktion, Proteinfällung). Das Schöne an der CC ist, dass diese Proben in einem organischen Lösungsmittel direkt in das ACQUITY UPC² System injiziert werden können und keine mühsame und zeitaufwendige Verdampfung oder Rekonstitution benötigt wird, wie sie häufig bei der RP-LC erforderlich ist. In Kapitel 5 wird dieses Thema ausführlicher behandelt. Für den Analytiker ist es immer nützlich, so viel wie möglich über eine Probe zu lernen (Abbildung 23) – je mehr Sie wissen, desto besser ist die Chance, eine robuste Methode zu entwickeln. Eine nützliche Information über die Löslichkeit von Verbindungen in verschiedenen organischen Lösungsmitteln ist der Verteilungskoeffizient (P) (üblicherweise als log₁₀ P bezeichnet). Der Verteilungskoeffizient (P) ist das Konzentrationsverhältnis einer Verbindung in den beiden Phasen eines Gemischs aus zwei nicht mischbaren Lösungsmitteln, normalerweise Wasser und 1-Octanol (Abbildung 24). Diese Koeffizienten sind ein Maß für die unterschiedliche Löslichkeit der Verbindung zwischen diesen beiden Lösungsmitteln. Der Verteilungskoeffizient misst, wie hydrophil oder hydrophob eine Verbindung ist.

In Bezug auf die CC könnte der Verteilungskoeffizient helfen, festzustellen, ob eine Zielverbindung für die Analyse durch das ACQUITY UPC² System in Frage kommt. Als Faustregel gilt, dass Verbindungen mit log P-Werten zwischen 2 und 9 geeignete Kandidaten für die CC sind.

Hilfslösungsmittel in der Convergence-Chromatographie

Das Hilfslösungsmittel spielt zwei Rollen. Zum einen beeinflusst es das Solvatationsvermögen von CO₂. Zweitens beeinflusst es die Wechselwirkung zwischen dem Analyten und der stationären Phase. Der Wechsel des Hilfslösungsmittels (z. B. Methanol zu Acetonitril) beeinflusst sowohl die Retention als auch die Selektivität. Die Rolle des Hilfslösungsmittels in der CC ist der des starken Lösungsmittels in der Reversed-Phase LC analog; CO₂ allein hat ungefähr die Elutionsstärke von Heptan.

Tabelle 1 in Kapitel 1 zeigt die eluotropen Reihen (Elutionsstärken) für eine Reihe organischer Lösungsmittel und hebt die vier gebräuchlichsten Hilfslösungsmittel für die CC hervor: Acetonitril, Isopropylalkohol, Ethanol und Methanol. Die aufgeführten Lösungsmittel sind alle mit CO₂ mischbar, was zu einem weiten Bereich von Retentions- und Elutionsstärken führt.

Hilfslösungsmittel, die der mobilen CO₂-Phase zugesetzt werden, verkürzen im Allgemeinen die Retentionszeit eines Analyten. Wenn die Konzentration des Hilfslösungsmittels zunimmt, ändert sich die Polarität der mobilen Phase, wodurch die Retentionszeit(en) verringert wird. Abbildung 25 veranschaulicht den Effekt einer Änderung der Hilfslösungsmittelkonzentration auf die Retention bei einer isokratischen Trennung. Mit abnehmender Konzentration des stark eluierenden Hilfslösungsmittels (Methanol) nimmt die Retention der Analyten zu. Dies ist das gleiche Phänomen, das bei der RP-LC beobachtet wird.

Abbildung 26 zeigt, wie sich die Stärke der mobilen Phase mit verschiedenen Hilfslösungsmitteln ändert. Methanol ist das stärkste Hilfslösungsmittel und eluiert die Analyten am schnellsten. Isopropylalkohol ist schwächer als Methanol, aber stärker als Acetonitril, während Acetonitril das schwächste der drei Hilfslösungsmittel bei der CC ist und die Analyten am längsten reteniert. Die gleiche Art des Chromatographieverhaltens tritt bei anderen Chromatographiemodi auf; stärkere Lösungsmittel verringern die Retention und eluieren Analyten schneller.

Bei der CC können verschiedene Hilfslösungsmittel gemischt werden, wodurch sich die Lösungsmittelstärke ändert und unterschiedliche Retentionen erzeugt werden. Abbildung 27 veranschaulicht den Effekt der Zugabe eines schwächeren Hilfslösungsmittels (Acetonitril) zu Methanol bei einer Gradiententrennung von Metoclopramid und verwandten Verunreinigungen. Mit steigender Acetonitrilkonzentration nimmt die Methanolkonzentration und damit die Lösungsmittelstärke ab und es werden längere Retentionszeiten beobachtet. Geringfügige Änderungen der Selektivität, verbesserte Auflösung und Peakschärfe mit einem anderen Hilfslösungsmittel für diese Trennung.

Additive in der Convergence-Chromatographie

Wie bei der RP-LC verbessern Additive in der CC die Peakform und/oder die Auflösung der Trennung. In Abbildung 27 wird die Auswirkung der Zugabe von Ammoniumformiat zu allen Gemischen von Hilfslösungsmitteln für alle vier Chromatogramme gezeigt. Additive können die Oberfläche der stationären Phase verändern oder als Ionenpaare wirken und die Selektivität zu verändern. Basische Additive neigen dazu, die Peakform basischer Verbindungen zu verbessern und können die Selektivität geringfügig verändern. Beispiele für basische Additive umfassen Ammoniumhydroxid, 2-Propylamin und Triethylamin. Saure Additive können die Peakform saurer Verbindungen verbessern und die Selektivität verändern. Gebräuchliche saure Additive umfassen Trifluoressigsäure, Ameisensäure und Essigsäure. Abbildung 28 zeigt eine Trennung von sauren Analyten, und wie dieses Beispiel zeigt, verbessert eine Erhöhung der Konzentration des sauren Additivs die Peakform.

Der Wechsel zwischen verschiedenen Additiven kann einen drastischen Einfluss auf die Peakform und Retention haben (Abbildung 29). Bei diesen basischen Analyten (Betablocker) führt Methanol als Hilfslösungsmittel ohne Additiv zu schlecht geformten Peaks. Die Zugabe von Ameisensäure verschlechtert die Peakform. Ameisensäure wird auch bei der Detektionswellenlänge von 220 nm absorbiert, was zu einer Basisliniendrift führt. Bei diesen starken Basen verbessert die Zugabe von Ammoniumacetat (20 mM) ebenso wie Diethylamin die Peakform erheblich, da sich die Peakform der basischen Verbindung bei Verwendung basischer Additive oft verbessert.

Probendiluent in der Convergence-Chromatographie

Auch wenn eine große Zahl von Probendiluenten mit der CC kompatibel ist, ist es manchmal doch notwendig, den richtigen Diluenten auszuwählen, um die beste Peakform zu erzielen. Die Stärke des Probendiluenten kann die Peakform und die Löslichkeit bei der CC stark beeinflussen. Wie bei anderen Chromatographiemodi empfehlen wir einen schwachen Probendiluenten (so schwach wie möglich), um die Löslichkeit des Analyten und die Peakform auszugleichen. Bei der CC bedeutet dies, dass die Probe in einem organischen Lösungsmittel in der Nähe des oberen Endes der eluotropen Reihe gelöst werden sollte (Tabelle 1). Waters empfiehlt Heptan/2-Propanol (90:10) als gutes allgemeines Lösungsmittel für ein Gleichgewicht zwischen Löslichkeit (Isopropylalkohol) und Peakform (Heptan). Der Wassergehalt der Probe sollte reduziert oder wenn möglich eliminiert werden. Abbildung 30 zeigt sieben überlagerte Chromatogramme der Peaks für die neutrale Verbindung Butylparaben. Wenn das Injektionsvolumen zunimmt, treten die Auswirkungen der Stärke des Injektionslösungsmittels auf die Peakform auf. Im starken Hilfslösungsmittel Methanol tritt Peakfronting auf, wenn das Injektionsvolumen zunimmt. Der schwächere Isopropylalkohol zeigt im Vergleich zu Methanol weniger Fronting und etwas höhere Peaks. Der empfohlene Probendiluent Isopropylalkohol/Hexan liefert scharfe, symmetrische Peaks für alle Injektionsvolumina.

Druck, Temperatur und Dichte

Die Einstellung des automatischen Rückdruckreglers (ABPR) beeinflusst die Retentionszeit, indem sie die Dichte des komprimierten CO₂ ändert. Mit steigender ABPR-Druckeinstellung nimmt die Dichte zu, während die Retentionszeiten abnehmen. Obwohl die Zusammensetzung der mobilen Phase den größten Einfluss auf die Trennung hat, kann eine Methode durch Abstimmung des Drucks und der Dichte der mobilen Phase feinabgestimmt werden. Abbildung 31 zeigt, dass eine Erhöhung der ABPR-Einstellung (Druck) bei unveränderten anderen Parametern zu kürzeren Retentionszeiten führt.

Wie bei der RP-LC beeinflusst die Säulentemperatur bei der CC sowohl die Selektivität als auch die Retention, wobei verschiedene Analyten in unterschiedlichem Maße betroffen sind. Eine Erhöhung der Säulentemperatur erhöht die Energie der Analytmoleküle, was, wie bei der LC oder GC, zu einer verringerten Retention auf stationären Phasen führen sollte. In der CC verringert jedoch eine Erhöhung der Temperatur bei konstantem Druck auch die Dichte der mobilen Phase, was ihr Solvatationsvermögen verringert und somit zu einer erhöhten Retention führt. Bei der CC haben Temperaturschwankungen einen gegenläufigen Effekt. Meistens nimmt mit steigender Säulentemperatur die Dichte der mobilen Phase ab und die Retentionszeiten werden länger (Abbildung 32). Beachten Sie auch das Vorhandensein eines zusätzlichen (kleinen) Peaks bei 50 °C. Dies ist auf leichte Selektivitätsunterschiede zurückzuführen, da die Temperatur verschiedene Analyten auf unterschiedliche Weise beeinflusst.

Peakform, Retention und Selektivität werden durch Variation und Verständnis der Rolle von Hilfslösungsmittel, Additiv, Probendiluent, Druck, Temperatur und stationärer Phase beeinflusst. Tabelle 5 fasst alle in diesem Kapitel genannten Parameter zusammen und zeigt, wie CC-Trennungen mit diesen Tools optimiert werden. Beachten Sie jedoch, dass die Bedeutung der einzelnen Parameter bei einer bestimmten Trennung variieren kann. Manchmal spielt bei der Beeinflussung der Selektivität zum Beispiel die stationäre Phase eine größere Rolle als die Wahl des Hilfslösungsmittels. In anderen Situationen spielt der Wechsel von Methanol zu 50:50 Methanol/Acetonitril eine größere Rolle als der Wechsel der Säulenchemien.

Protokoll zur Entwicklung einer generischen Methode – Ansatz 1

Abbildung 33 beschreibt ein Protokoll, mit dem schnell festgestellt werden kann, ob eine Probe in einem mit der CC kompatiblen Injektionslösungsmittel gelöst werden kann. Wenn der log P des Analyten einen Wert zwischen -2 und 9 hat, ist dies möglich. Wenn er weniger als -2 beträgt, ist der Analyt nur in einem wässrigen Lösungsmittel löslich und daher möglicherweise nicht mit der CC kompatibel. Wenn der log P-Wert des Analyten unbekannt ist, muss er sich vor der Injektion in einem geeigneten organischen Lösungsmittel lösen. Denken Sie daran, dass sich die Convergence-Chromatographie eher wie eine Normalphasentrennung verhält, bei der Lösungsmittel wie Methanol ein sehr starkes Lösungsmittel sind (das Gegenteil der Reversed-Phase LC, wo es ein relativ schwaches Lösungsmittel ist).

Daher muss die Probe in einem schwächeren Lösungsmittel wie Heptan/Isopropylalkohol gelöst (oder verdünnt) werden. Es muss ein Gleichgewicht zwischen der Löslichkeit der Probe und der Peakform gefunden werden; der Einfluss des Probendiluenten auf die Peakform bei der CC wurde weiter oben in diesem Kapitel besprochen.

Neben der Auswahl eines Probendiluenten sind bei der Entwicklung einer Methode noch weitere Aspekte zu berücksichtigen. Welche Chromatographiebedingungen sind zum Beispiel für den fraglichen Analyten geeignet? Abbildung 34 zeigt einen empfohlenen Satz von Startbedingungen, von denen bekannt ist, dass sie eine große Zahl von Analyten retenieren und trennen. Wie bei jeder Chromatographiemethode sind diese Bedingungen nicht für alle Fälle geeignet und es können Strategien zur Verbesserung der Peakform und zur Änderung von Selektivität und Retention angewendet werden.

Für solche Fälle zeigen die Abbildungen 35, 36 und 37 die systematischen Ansätze zur Verbesserung der Peakform, zur Änderung der Retention und zur Änderung der Selektivität, und sie unterscheiden sich nicht wesentlich von denen, die bei der Reversed-Phase LC verwendet werden. Abbildung 35 zeigt ein Protokoll zur Verbesserung der Peakform. Der anfängliche Ausgangspunkt ist ein empfohlener Satz von Bedingungen, basierend darauf, ob die nachzuweisenden Analyten hauptsächlich basisch oder sauer sind. Saure Verbindungen neigen dazu, unter sauren Bedingungen eine bessere Peakform aufzuweisen, und basische Verbindungen neigen dazu, unter basischen Bedingungen eine bessere Peakform aufzuweisen. Zu den Strategien zur Verbesserung der Peakform gehören das Ausprobieren eines anderen Additivs, das Ändern der Konzentration des Additivs und das Ändern der Säulenchemie.

Abbildung 36 zeigt ein Protokoll zur Erhöhung der Retention. Wie bei jeder Form der Flüssigchromatographie besteht die erste Möglichkeit darin, ein anderes (schwächeres) Hilfslösungsmittel zu verwenden. Methanol ist das stärkste Hilfslösungsmittel, das bei der CC verwendet wird; die Verwendung eines schwächeren Hilfslösungsmittels, wie z. B. Acetonitril oder eines anderen Alkohols, verlängert die Retentionszeit auf der Säule. Das Abflachen oder Verringern der Steigung des Gradienten (Verringern des endgültigen Prozentsatzes des Hilfslösungsmittels oder Erhöhen der Gradientendauer) kann ebenfalls wirksam sein. Das Mischen von Hilfslösungsmitteln und die Verringerung der Methanolkonzentration schwächt die Gesamtstärke des Hilfslösungsmittels, wodurch die Retention erhöht wird. Die Möglichkeit, die Dichte der mobilen Phase in der Säule zu manipulieren, ist eine einzigartige Eigenschaft der SFC und der CC. Dadurch ändert sich die Gesamtretention, da eine niedrigere Dichte einer höheren Retention entspricht. Dies erfolgt durch Verringern der ABPR-Einstellung und/oder Erhöhen der Temperatur. Schließlich ist die Verwendung einer anderen Säulenchemie eine weitere Strategie zur Erhöhung der Retention.

Abbildung 37 zeigt ein Protokoll zur Änderung der Selektivität (Elutionsreihenfolge, relative Retention) der Trennung. Ein Ansatz ist der Versuch, andere Hilfslösungsmittel zu verwenden, z. B. Acetonitril anstelle von Methanol. Der Wechsel von einem alkoholischen, protischen Hilfslösungsmittel zu einem nicht-alkoholischen, aprotischen Hilfslösungsmittel wie Acetonitril hat einen viel größeren Einfluss auf die Selektivität als der Wechsel von Methanol zu einem anderen Alkohol. Da eine Verringerung der Methanolkonzentration die Gesamtstärke des Hilfslösungsmittels schwächt, kann dies die Retention erhöhen und die Selektivität verändern. Die Manipulation der Dichte der mobilen Phase kann auch die gesamte Analytretention verändern, da diese Dichteeffekte für spezifische Analyten variieren können, was ausreichen kann, um eine gegebene Trennung zu optimieren. Schließlich empfiehlt dieses Protokoll gegebenenfalls eine andere Säulenchemie.

Protokoll für eine Methodenentwicklungsstrategie für eine Säulenserie – Ansatz 2

Das im vorherigen Abschnitt beschriebene Protokoll zur Methodenentwicklung konzentriert sich auf generische Startbedingungen und den Einfluss unterschiedlicher Eigenschaften der mobilen Phase auf die Feinabstimmung einer Trennung. In diesem Abschnitt werden zwei weitere Alternativen – eine für die chirale und die andere für die achirale – beschrieben. Beide Alternativen erfordern Kombinationen einer Säule und einer Methode, die statistisch zur höchsten Erfolgsrate für eine große Gruppe unterschiedlicher Testverbindungen führt. Im Allgemeinen wird bei der Auswahl der CC-Säule „Brute-Force“ angewendet – die in diesem Abschnitt vorgeschlagenen Protokolle schlagen jedoch eine schrittweise Strategie vor.

Methodenentwicklungsstrategie für chirale Trennungen mit UPC² Trefoil Säulen

Das empfohlene Screeningprotokoll für chirale Verbindungen basiert auf drei chiralen Chemikalien von Waters UPC² Trefoil – AMY1, CEL1 und CEL2. Das in Abbildung 38 gezeigte Screeningprotokoll empfiehlt die Verwendung dieses Screenings in vier Schritten und vier Säulen mit optimiertem Gemisch von Hilfslösungsmitteln für beste Erfolgsaussichten.

Laut Protokoll sollte das Screening mit AMY1 gestartet werden, wobei eine (1:1:1) Mischung aus Ethanol:Isopropanol:Acetonitril mit 20 mM Ammoniumacetat verwendet wird. Wenn mit der Methode nicht die gewünschte Trennung erzielt wird, sollte die nächste Methode eine CEL1-Säule mit einer (1:1) Mischung aus Methanol und Isopropanol mit 0,2 % TFA verwenden – und so weiter. Detaillierte Methodenbedingungen finden Sie im Kasten in Abbildung 38.

Methodenentwicklungsstrategie für achirale Trennungen mit UPC² Torus Säulen

Das Screeningprotokoll für eine achirale Trennung folgt einem ähnlichen Ansatz. Dies kann in maximal drei Schritten erreicht werden, die nachfolgend beschrieben werden.

Schritt 1

Beginnen Sie mit einem schnellen Scouting-Schritt unter Verwendung einer Torus 2-PIC (3,0 x 100 mm) Säule und den folgenden Chromatographiebedingungen: 1,2 mL/min, 4 – 50 % MeOH in 3 Minuten, 30 °C, 2000 psi BPR

Notieren Sie auf der Grundlage der erhaltenen Ergebnisse Folgendes:

1. a) Ob die Anforderungen an Selektivität und Peakform erfüllt sind. Methode nur bei Bedarf weiter optimieren
2. b) Ob eine gute Selektivität erzielt wurde, jedoch die Peakform verbessert werden muss. Anschließend wird eine Torus 2-PIC Säule mit einem Additiv verwendet, entweder Ameisensäure für Säuren oder einem basischen Additiv für Basen.
3. c) Wenn die Daten zeigen, dass eine andere Selektivität erforderlich ist, fahren Sie mit Schritt 2 fort

Schritt 2

Wählen Sie je nach Art der Probe den geeigneten Weg aus, der im Flussweg als Definiertes Screening angegeben ist. Fahren Sie dann mit der empfohlenen Kombination aus Säule und Hilfslösungsmittel den Flussweg entlang fort, bis eine geeignete Trennung erzielt wird.

Schritt 3

Zur Feinabstimmung der Trennung kann die Trennung durch Anpassen der Zusammensetzung des Hilfslösungsmittels, der Temperatur, des Additivs und des Drucks optimiert werden. Die Abbildungen in Abschnitt 4.7 zeigen, wie eine Methode auf diese Weise optimiert wird.