Leitfaden für Einsteiger in die Convergence-Chromatographie

Der grundlegende Mechanismus jeder chromatographischen Trennung besteht darin, Bedingungen zu schaffen, unter denen sich alle Analytmoleküle in der Probenmischung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das System bewegen, sodass sie, wenn sie von der analytischen Trennsäule eluieren, ausreichend voneinander getrennt sind, um nachgewiesen und quantifiziert zu werden. Um diesen Prozess durchzuführen, besteht die Chromatographie aus zwei Hauptkomponenten – einer stationären und einer mobilen Phase. Die stationäre Phase hat in erster Linie die Aufgabe, die Bewegung der Verbindungen aufzuhalten oder zurückzuhalten, während die mobile Phase dazu dient, die Verbindungen zu halten und sie zu zwingen, sich vom Eingang zum Ausgang des Systems zu bewegen. Dies ist der grundlegende Mechanismus für GC, LC oder CC. Der Hauptunterschied zwischen der CC und LC oder GC besteht darin, wie die Eigenschaften der mobilen Phase das jeweilige chromatographische Verhalten beeinflussen.

Rolle der mobilen Phase bei der CC im Vergleich zur LC und GC

Bei der GC ist die mobile Phase normalerweise ein inertes oder unreaktives Gas – typischerweise He oder N₂. Bei den Betriebstemperaturen und -drücken der GC kann die mobile Phase keine Analytmoleküle lösen oder die Oberfläche der stationären Phase verändern. Die mobile Phase der GC fungiert hauptsächlich als Träger oder Treiber der Analytmoleküle durch die GC-Säule. Die Retention und Trennung des Analyten wird ausschließlich durch Wechselwirkungen zwischen den Molekülen des Analyten mit der stationären Phase vermittelt. Dies wird ausschließlich durch Wechselwirkungen zwischen Analytmolekülen mit der stationären Phase vermittelt. In Abbildung 3 ist dies schematisch mit dem leeren Raum um die Analytmoleküle dargestellt.

Bei der LC hingegen spielt die mobile Phase eine aktive Rolle, bei der ihre Moleküle sowohl mit den Analytmolekülen als auch mit der stationären Phase in starker Wechselwirkung stehen. Die mobile Phase beeinflusst die Retention des Analyten, indem sie nicht nur die Analyten direkt solvatisiert, sondern auch auf die Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase einwirkt, indem sie um die Oberfläche der stationären Phase konkurriert (Abbildung 3). 

Abbildung 3 zeigt die LC im RP-LC- und NP-LC-Modus. Beachten Sie, dass einer der Hauptunterschiede zwischen diesen beiden LC-Modi in der Zusammensetzung der mobilen Phase liegt – RP-LC ist wasserbasiert, während NP-LC organisch basiert ist. Bei der RP-LC modifiziert die mobile Phase auf Wasserbasis in Verbindung mit der stationären C₁₈-Phase die Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären Phase – und spielt so eine wichtige Rolle bei der Auflösung von Probenanalyten in einer Vielzahl von Verbindungsgemischen. Bei der RP-LC-Methodenentwicklung wird die erste Modifikation oft an der mobilen Phase vorgenommen, nicht an der stationären Phase. Im Vergleich dazu spielt die mobile Phase auf Hexan- oder Heptanbasis bei der NP-LC eine relativ moderate Rolle und die Trennung wird weitgehend durch Variieren der chemischen Zusammensetzung der stationären Phase bestimmt.

Die Rolle der mobilen Phase bei der CC liegt aufgrund der einzigartigen Eigenschaften von CO₂ irgendwo zwischen der RP-LC und NP-LC – superkritisch oder nicht. Komprimiertes CO₂ ist unpolar wie Heptan oder Hexan. Auf dieser Grundlage ähnelt die CC eher der NP-LC. Ein wichtiger Unterschied besteht jedoch darin, dass CO₂ sich mit polaren Hilfslösungsmitteln vollständig mischen kann, z. B. Methanol, Ethanol, Acetonitril usw. und daher im Gradientenmodus verwendet werden kann, im Gegensatz zur NP-LC, die fast immer im isokratischen Modus verwendet wird. Darüber hinaus sind die mobilen Phasen bei der CC viel toleranter gegenüber kleinen Mengen Wasser als bei der NP-LC, wo sie eine starke Rolle bei der Elution von Analyten spielen können.

Im nächsten Abschnitt wird ein systematischer Vergleich der CC mit RP-LC und NP-LC vorgestellt, der auf den Eigenschaftsunterschieden zwischen ihren Hauptlösungsmitteln basiert.

Rolle der CO2-Eigenschaften bei der Beeinflussung des chromatographischen Verhaltens

Mischbarkeit von CO2 mit anderen Lösungsmitteln

CO₂ ist ein unpolares Lösungsmittel mit einem Polaritätsindex ähnlich wie Heptan (= 0,1). Aber im Gegensatz zu Heptan hat CO₂ ein von null verschiedenes Quadrupolmoment (-13,4 ± 0,4 × 10^-40 C m²) und es ist vollständig mit hochpolaren organischen Lösungsmitteln mischbar, z. B. Acetonitril (Polaritätsindex = 5,8) und Methanol (Polaritätsindex = 5,1). Es ist zwar mit Wasser schwer mischbar (Polaritätsindex = 10,2), jedoch mit Methanol/Wasser-, Isopropanol/Wasser- oder Acetonitril/Wasser-Gemischen mit erheblichen Wasseranteilen mischbar. Ein so großer Mischbarkeitsbereich ermöglicht es der mobilen Phase bei der CC, ihre Polarität über einen größeren Bereich als mobile Phasen bei der NP-LC und RP-LC auszudehnen. Tabelle 1 vermittelt ein anschauliches Bild der Situation in Bezug auf die eluotropen Werte (Elutionsstärke) und Polaritätsindizes der bei der RP-LC, NP-LC und CC verwendeten Lösungsmittel.

Beachten Sie, dass in Tabelle 1 für die wasserbasierte mobile Phase der RP-LC nur ein begrenzter Bereich der eluotropen Reihe verwendet werden kann, da Wasser mit den meisten anderen organischen Lösungsmitteln nur begrenzt mischbar ist. Ebenso lässt die mobile Phase auf Hexan/Heptan-Basis bei der NP-LC aufgrund der begrenzten Mischbarkeit unpolarer organischer Verbindungen mit hochpolaren Lösungsmitteln keinen weiten eluotropen Bereich zu. Ein weiteres Problem bei der NP-LC ist, dass nicht alle organischen Lösungsmittel untereinander gut mischbar sind, was zur Inkompatibilität bestimmter Gemische führt. Bei der CC ist dagegen komprimiertes CO₂ mit allen anderen Lösungsmitteln der gesamten eluotropen Reihe mischbar, sodass die Selektivität der Trennungen durch ein breites Spektrum an mobilen Phasen beeinflusst werden kann (siehe Tabelle 1). Obwohl CO₂ unpolar ist, ist die CC doch mit RP-LC vergleichbar, da sie im Vergleich zu NP-LC eine viel breitere eluotrope Stärke aufweisen kann – insbesondere auf der Seite mit der höheren Polarität. Durch Kombination von CO₂ mit Methanol kann zum Beispiel die Eluentenstärke der mobilen Phase von 0 bis 0,73 E^o programmiert werden.

Neben einem erweiterten eluotropen Bereich ist die CO₂-basierte mobile Phase der CC mit einer Vielzahl von Chemikalien in stationären Phasen kompatibel. Tabelle 2 listet die stationären Phasen auf, die üblicherweise für NP-LC und RP-LC verwendet werden. Die meisten RP-LC-Trennungen werden mit stationären C₁₈-Phasen durchgeführt, wobei andere gebundene Phasen in relativ wenigen Fällen verwendet werden. Einige der aufgeführten stationären Phasen können aufgrund ihrer höheren Polarität nicht mit der RP-LC verwendet werden. Ebenso wird bei der NP-LC die Säulenauswahl durch den Polaritätsbereich der mobilen Phase eingeschränkt. Bei der CC ist aufgrund des breiteren Polaritätsbereichs die Auswahl all dieser Säulenchemien möglich – was einen größeren Bereich der Selektivitätsauswahl öffnet (siehe Abbildung 4). Wie von West und Lesellier angeführt, eröffnet dies die interessante Möglichkeit, Säulen mit sehr unterschiedlichen Polaritäten zu koppeln, da alle diese Chemikalien mit der gleichen Zusammensetzung der mobilen Phase arbeiten können.

Ein weiterer Grund für die Wichtigkeit der CO₂-Mischbarkeit besteht darin, dass die CC mit einer Vielzahl von Probendiluenten (Lösungsmittel, in dem die Probe gelöst oder verdünnt wird) kompatibel ist. Diese Funktion der CC wirkt sich stark auf den gesamten Workflow des Labors aus. Der größte Engpass in einem Chromatographielabor ist oft die Probenvorbereitung. Die meisten gängigen Probenvorbereitungsmethoden führen dazu, dass die zu untersuchenden Analyten in einem Lösungsmittel gelöst sind, das mit dem vorliegenden LC-System nicht kompatibel ist. Zum Beispiel lösen sich viele Analyten leicht in einem organischen Lösungsmittel – und werden daher am besten damit extrahiert. Da große Mengen organischer Lösungsmittel mit der RP-LC nicht kompatibel sind, sind häufig zusätzliche Schritte erforderlich, um die organische Lösung oder das Extrakt in eine RP-LC-kompatible Lösung umzuwandeln (Abbildung 5). Die CC ist kompatibel mit der direkten Injektion von Proben, die in organischen Lösungsmitteln gelöst sind. Schritte zum Verdampfen organischer Lösungsmittel und zur Rekonstitution (sehr zeitaufwendig) der Probe in wässrigen Diluenten, die für Reversed-Phase-Trennungen erforderlich sind, sind nicht mehr erforderlich. Dies führt in einem Gesamtassay zu erheblichen Kosteneinsparungen. Darüber hinaus kann die Analysezeit viel kürzer sein – eine erhebliche Auswirkung, insbesondere für Labore mit mehreren RP-LC-Systemen, die für die Analyse zahlreicher Proben eingerichtet sind.

Kurz gesagt, durch Kombination von unpolarem komprimiertem CO₂ mit einem Hilfslösungsmittel an einem der beiden Enden des eluotropen Spektrums, verbunden mit einer größeren Vielfalt an für die CC kompatiblen stationären Phasen, kann ein außergewöhnlich großer Selektivitätsbereich untersucht werden, wodurch die CC auf ein breites Spektrum von Trennungen anwendbar ist.

CO2-Transporteigenschaften

Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft der CC ist die niedrige Viskosität und das daraus resultierende hohe Diffusionsvermögen der Analytmoleküle in der mobilen Phase der CC. Aus der Sicht der physikalischen Eigenschaften wird die Effizienz einer Chromatographiesäule durch das Diffusionsvermögen des Analyten in der mobilen Phase gesteuert. Je höher das Diffusionsvermögen eines Moleküls ist, desto schneller wandert es in die Poren der stationären Partikel hinein und aus diesen heraus, was zu einer hohen Effizienz selbst bei hohen Geschwindigkeiten der mobilen Phase führt. Bei der CC ist die Viskosität der mobilen Phase auch nach Zugabe erheblicher Mengen an flüssigem Modifikator (z. B. für CO₂/Methanol (70/30, Mol/Mol %) mindestens halb so groß wie die der mobilen Phasen in der LC (siehe Tabelle 3). Dies bedeutet, dass die CC bei viel höheren Flussraten der mobilen Phase betrieben werden kann, ohne dass die Säuleneffizienz beeinträchtigt wird. Dies macht die CC zu einem hervorragenden Kandidaten für Hochdurchsatzanalysen.

Der Vorteil von CC in zwei Hauptapplikationsbereichen, dem schnellen chiralen Screening und als Ersatz für die Normalphasen-Chromatographie bei achiralen Trennungen, ist signifikant. Für das chirale Screening wird die Analysezeit von 20 Minuten auf nur noch 3 Minuten verkürzt, was einer siebenfachen Zeitersparnis bei einer höheren Auflösung entspricht. Diese Verbesserung wurde hauptsächlich durch die Verwendung von Lösungsmittelgradienten in der CC verursacht, die in der NP-LC nicht möglich waren. Ein weiterer Vorteil der CC ist, dass weniger Lösungsmittel verbraucht wird, was zu erheblichen Kosteneinsparungen führt.

Durch den Ersatz normalphasiger organischer Lösungsmittel durch eine mobile Phase, die hauptsächlich aus komprimiertem CO₂ besteht (Abbildung 6), sinken die Kosten pro Analyse von etwa sechs Dollar auf nur fünf Cent pro Probe. Die finanziellen Gesamtauswirkungen durch kürzere Analysezeiten und geringere Beschaffungs- und Entsorgungskosten für Lösungsmittel sind außergewöhnlich.

Rolle anderer vorteilhafter Eigenschaften

In Tabelle 4 sind die Vorteile von mobilen Phasen bei der CC gegenüber mobilen Phasen bei der LC aufgeführt. Neben den Vorteilen der Mischbarkeit und der niedrigen Viskosität gibt es auch eine niedrige Oberflächenspannung. Eine niedrige Oberflächenspannung ermöglicht es der mobilen Phase, schneller in die Poren der Partikel der stationären Phase einzudringen, was zu einer schnelleren Säulenäquilibrierung führt.

Weitere Eigenschaften von CO₂, die CC als Chromatographiesystem so interessant machen, sind, dass es billiger und sicherer im Betrieb ist – und es ist auch nachhaltiger. CO₂ ist leicht verfügbar und nicht von anderen kritischen Prozessen abhängig (z. B. Acetonitril, das als Nebenprodukt der petrochemischen Industrie anfällt). CO₂ in kommerzieller Qualität ist klimaneutral und gilt als umweltfreundliches Lösungsmittel. CO₂ ist viel günstiger als andere organische Lösungsmittel und CO₂ kann (wenn es nicht recycelt wird) direkt in die Luft abgegeben werden, ohne dass Entsorgungskosten anfallen.

CO₂ ist nicht brennbar und untoxisch und einfacher zu lagern. Es ist unmöglich, eine mobile Phase zu finden, die die Eigenschaften von CO₂ – Mischbarkeit und niedrige Viskosität – kombiniert, das so wirtschaftlich und umweltfreundlich wie CO₂ ist, was die CC der LC für viele Applikationen überlegen macht. Der kumulative Nutzen all dieser Eigenschaften, der in Tabelle 4 aufgeführt ist, macht CO₂ zu einem einzigartigen Lösungsmittel.

Superkritisch oder nicht?

Wie bereits erwähnt, spielt es in der CC aus chromatographischer Sicht keine Rolle, ob die mobile Phase superkritisch ist oder nicht. Für die Durchführung der chromatographischen Trennung muss die mobile Phase bei der CC jedoch unbedingt homogen sein und kein heterogenes Gas-Flüssigkeits-Gemisch. Um sicherzustellen, dass sie homogen ist, wird die mobile Phase bei der CC über einem bestimmten Druck gehalten, der über einen automatischen Rückdruckregler (ABPR) einfach eingestellt werden kann.