Leitfaden für Einsteiger in die Convergence-Chromatographie
Einführung
Entwicklung der Convergence-Chromatographie
1.1 Die Convergence-Chromatographie (CC) ist eine Trenntechnologie, die komprimiertes CO2 als Hauptlösungsmittel in der chromatographischen mobilen Phase bei Drücken zwischen dem 100- bis 400-fachen des Atmosphärendrucks verwendet. CO2 wird meistens mit flüssigen Hilfslösungsmitteln gemischt (z. B. Methanol, Ethanol, Isopropanol, Acetonitril), um die Eigenschaften der mobilen Phase zu verändern; ähnlich dem Mischen dieser Hilfslösungsmittel mit Wasser, um die Eigenschaften der mobilen Phase bei der Reversed-Phase-Flüssigchromatographie (RP-LC) zu modulieren. Diejenigen, die mit der modernen Version der superkritischen Fluidchromatographie (SFC) vertraut sind, werden sofort die Ähnlichkeit der CC mit der SFC sehen. Denn in Wirklichkeit ist CC eine umbenannte Version der modernen SFC. Um zu verstehen, was wir meinen, müssen wir einen Blick zurück auf die Entwicklung der SFC werfen, was wir in den folgenden Absätzen tun.
Die SFC wurde als chromatographische Technik entwickelt, bei der Lösungsmittel unter überkritischen Bedingungen eingesetzt werden, um die Möglichkeiten der Gaschromatographie (GC) zu erweitern. Um das Problem der Analyse von Verbindungen zu lösen, die nur bei hohen Temperaturen eluieren, sich aber bei diesen Temperaturen zersetzen, verwendeten Klesper und seine Mitarbeiter bei der GC höhere Drücke, um die hohen Temperaturen zu kompensieren. Superkritische Bedingungen wurden ausgewählt, um (a) das Solvatationsvermögen eines Hochdruckgases zu nutzen und um (b) Bedingungen zu vermeiden, bei denen die mobilen Phasen nicht mehr als ein einziges Lösungsmittel fließen (Gas-Flüssig-Phasentrennung), indem entweder der Druck oder die Temperatur oder beides variiert wird. Später erfuhren sie, dass man durch Variieren der Lösungsmitteldichte die Lösungsmittel stärke modulieren kann – der Hauptvorteil des Arbeitens unter superkritischen Bedingungen. Da Flüssigkeiten unter superkritischen Bedingungen stark komprimierbar sind, verändern selbst geringfügige Druckänderungen die Dichte des Lösungsmittels und damit die Analytretention stark. Tatsächlich kann man durch Variieren des Betriebsdrucks einen Lösungsmittelgradienten erzeugen, was zu einer Veränderung der Dichte führt, wodurch das Zumischen organischer Hilfslösungsmittel zur Erzeugung eines Gradienten überflüssig gemacht wird. Diese Möglichkeit eines einzigen Trennmodus für ungiftige Lösungsmittel weckte unter den analytischen Wissenschaftlern großes Interesse und Aufregung.
Die Aufregung war jedoch nur von kurzer Dauer, als sich allmählich herausstellte, dass das Verändern der Dichte, so nützlich es auch ist, die Polarität des Lösungsmittels möglicherweise nicht genug verändert, um auf den Bereich von Verbindungen anwendbar zu sein, die durch andere leistungsfähige chromatographische Techniken getrennt werden können wie Reversed-Phase-Flüssigchromatographie (RP-LC). Tatsache ist, dass CO2, das sich als bestes Lösungsmittel für die SFC entwickelt hat, selbst bei signifikanter Veränderung der Dichte ein unpolares Lösungsmittel bleibt. Zur Trennung der meisten polaren Analyten ist es dann notwendig, polare Hilfslösungsmittel zu zusetzen, z. B.. Methanol. Diese Erkenntnis änderte den Kurs der SFC-Entwicklung. Obwohl es viele wichtige Applikationen gibt, die immer noch allein auf der Veränderung der Dichte beruhen, verlassen sich SFC-Anwender mehr auf den Mix flüssiger organischer Hilfslösungsmittel und Additive, genau wie bei der RP-LC, um eine größere Vielfalt von Analyten zu trennen.
CO2 ist mit sehr polaren Lösungsmitteln vollständig mischbar (z. B. Methanol, Ethanol, Acetonitril) und Lösungsmittelgradienten, die sehr hohe Modifikatorzusammensetzungen erreichen (z. B. 60 %), werden routinemäßig verwendet. Derartige Praktiken führten wiederholt zu Fragen der Superkritikalität der mobilen Phase. Bei höheren Modifikatorkonzentrationen und bei Temperaturen und Drücken, die typischerweise in der SFC verwendet werden, ist die mobile Phase während der meisten Zeit der Methode nicht superkritisch. Und was noch wichtiger ist, solche Abweichungen von den superkritischen Bedingungen machen bei der Chromatographie keinen Unterschied. Warum also sollte eine Technologie, die nicht vom Erreichen eines superkritischen Zustands des Lösungsmittels abhängt, immer noch als superkritische Fluidchromatographie bekannt sein? Es gab Vorschläge, die moderne Version der SFC mit einem anderen Namen zu benennen, z. B. Sub/Super-Critical Fluid Chromatography, Simplified Fluid Chromatography, Separations Facilitated by Carbon-dioxide oder einfach mit der Abkürzung – SFC, aber keine wird dem erweiterten Applikationsbereich ihrer heutigen Verwendung in analytischen Labors gerecht.
Neben der Verwirrung hinsichtlich ihrer Identität war die SFC auch mit akuten technologischen Schwierigkeiten konfrontiert, die einen Einsatz als ernsthaftes Analysegerät verhinderten. Die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Methode waren schlecht, da ältere Geräte ein komprimierbares Lösungsmittel wie CO2 nicht zumindest ebenbürtig mit modernen HPLC- und UPLC-Geräten zuverlässig und wiederholt handhaben konnten.
Das änderte sich, als die Waters Corporation 2012 die Ultra Performance Convergence Chromatography (UPC2) einführte (siehe Abbildung 1), um sowohl die Geräteprobleme als auch das Namensdilemma anzugehen. Mit der wesentlich höheren Robustheit des Geräts, die in Kapitel 3 ausführlich besprochen wird, und dem neuen Namen, um sich von älteren Technologien abzuheben, wurde die SFC endlich zu einer ernsthaften Option für analytische Studien.
Abbildung 1. Das ACQUITY UPC2 System
Was bedeutet „Konvergenz“ in der Convergence-Chromatographie?
Das Wort „Konvergenz“ in der Convergence-Chromatographie wurde von Giddings Beobachtungen entlehnt, eine Technologie zu haben, die die bestehenden chromatographischen Technologien – GC und Flüssigchromatographie (LC) – in einem System konvergiert. Giddings beschreibt die SFC als eine Technik zur Überbrückung der LC und GC und zur Erweiterung des Einsatzes mobiler Phasen über die Grenzen der Superkritikalität hinaus. Convergence-Chromatographie wird heute am häufigsten mit organischen Hilfslösungsmitteln verwendet, die sowohl super- als auch subkritische Bereiche umfassen und über die begrenzte Möglichkeit der Veränderung der Dichte bei der reinen CO2-SFC hinausgehen. Anstatt nur die Lücke zwischen der GC und der LC zu schließen, ist das Potenzial der SFC viel größer als ursprünglich angenommen.
