Guide complet pour l’hydrolyse et l’analyse des acides aminés

Bien que ce manuel se concentre principalement sur les premières étapes de l’analyse des acides aminés, notamment sur la préparation des échantillons pour l’hydrolyse, cette section présente brièvement les approches de quantification les plus couramment utilisées pour l’analyse des acides aminés. Ces exemples se basent sur des résultats d’analyse des acides aminés préalablement obtenus. La concentration initiale de l’échantillon doit être calculée. Ces exemples supposent que des réactifs AccQ•Tag ou AccQ•Fluor ont été utilisés pour la dérivatisation.

Avant de procéder à la quantification :

• Vérifiez que tous les pics sont correctement identifiés.
• Si les temps de rétention ne correspondent pas, vérifiez les valeurs de votre tableau d’étalonnage.
• Vérifiez que tous les pics ont bien été intégrés.

Certaines analyses ont pour simple objectif de déterminer la concentration de l’échantillon analysé. Ces résultats sont généralement exprimés en concentrations molaires, par exemple en µmol/L. Les résultats chromatographiques sont généralement exprimés en picomoles. Pour déterminer la concentration, on divise la quantité d’acides aminés en picomoles rapportée par le logiciel de chromatographie par le volume d’injection. On multiplie ensuite cette valeur par le volume de diluant divisé par le volume dérivatisé. Enfin, multipliez par le facteur de dilution, puis convertissez les unités en µmoles par litre.

Exemple de calcul :
Pour déterminer la concentration de l’acide aminé dans l’échantillon d’origine, à partir de la valeur rapportée, on utilise la formule suivante :

où :

pmol AA = quantité rapportée pour les acides aminés dans l’échantillon Vi = volume d’injection en µL, typiquement 1 µL

Vd = volume dérivatisé en µL, typiquement 10 µL

Vr = volume de diluant utilisé pour reconstituer l’échantillon, en µL Dil. Factor = facteur de dilution

Exemple :

Un échantillon initial de 100 µL de protéine hydrolysée a été dilué à 1:1 avec un étalon interne. Une aliquote de 10 µL a été dérivatisée. Le volume d’injection était de 1 µL et la quantité rapportée était de 312,5 pmol pour l’asparagine (Asn).

La concentration en Asn en µmol/L est ici de :

La détermination de la composition en acides aminés d’une protéine hydrolysée implique de calculer les rapports molaires des composés d’un échantillon.

Chaque protéine pure possède un nombre stœchiométrique de résidus spécifique pour chaque acide aminé qu’elle contient. Dans l’idéal, les résultats d’une analyse produisent des rapports molaires qui sont des nombres entiers. Les valeurs observées se rapprocheront plus ou moins de cet idéal en fonction de la pureté de la protéine ou du peptide, des conditions d’hydrolyse et de la qualité de l’analyse des acides aminés.

Exemple 1 (voir tableau ci-dessous) :

1. Dans un tableau, indiquez la quantité observée en picomoles pour chaque acide aminé (à partir de l’analyse).
2. Après examen, estimez le nombre de résidus (Composition estimée) pour chaque acide aminé. Remarque : Les résidus observés correspondent à la concentration molaire relative de chaque acide aminé. Divisez toutes les quantités observées en picomoles par celle de l’acide aminé le moins abondant et arrondissez à l’unité la plus proche.
3. Additionnez la quantité en picomoles et le nombre de résidus pour tous les acides aminés.
4. Calculez la quantité moyenne en picomoles par résidu en divisant la somme des quantités observées par la somme de la composition estimée.
5. Divisez chaque quantité observée par la quantité en picomoles par résidu pour déterminer la composition observée.

AVERTISSEMENT : Il est plus difficile d’estimer le nombre de résidus pour les grosses protéines, car elles requièrent plus de précision.

AVERTISSEMENT : Le rendement de certains acides aminés après hydrolyse peut être variable (Ser, Tor, Tyr et Met se dégradent ; les liaisons Val et Ile peuvent être difficiles à rompre).

Remarque : Pour améliorer la quantification dans de tels cas, il est recommandé d’effectuer une étude de l’évolution de la réaction dans le temps. En général, les échantillons sont hydrolysés pendant 24, 48 et 72 (ou 96) heures. Les valeurs d’acides aminés labiles sont déterminées par extrapolation à zéro, tandis que les valeurs d’Ile et de Val sont déterminées à partir de l’hydrolyse la plus longue.

Exemple 2 :
Dans certains cas, comme indiqué précédemment, le calcul du pourcentage molaire (nombre de résidus de chaque acide aminé pour 100 résidus de protéine) permet d’obtenir des résultats satisfaisants. Pour cela, utilisez la formule suivante :

Si une estimation de la masse moléculaire de la protéine est disponible, deux approches peuvent être utilisées pour calculer une composition approximative :

1. Estimez la masse moléculaire (MW) de l’échantillon.
2. Additionnez les rendements totaux en acides aminés en picomoles.
3. Divisez la masse moléculaire par 110, qui correspond à la masse moléculaire moyenne des acides aminés. Remarque : Ce calcul donne une bonne approximation de la longueur totale de la chaîne ou du total des acides aminés.
4. Divisez le rendement total par la longueur de chaîne (égale à la quantité molaire d’échantillon injectée).
5. Divisez la quantité de chaque acide aminé par la quantité molaire injectée (égale au nombre de résidus par mole). Examinez les écarts par rapport aux nombres entiers.
6. Faites varier légèrement le diviseur (quantité molaire injectée) vers le haut ou vers le bas pour minimiser l’écart par rapport aux valeurs entières (obtenues à l’étape 5). Pour cette étape, vous pouvez vous aider d’un tableur informatique ou d’un logiciel d’acides aminés sur mesure permettant de trouver les plus petits écarts.
7. N’oubliez pas que les valeurs des acides aminés labiles et formant des liaisons stables peuvent s’écarter significativement des valeurs entières en raison de leur faible rendement après hydrolyse.

Cette procédure alternative nécessite plus de connaissances sur l’échantillon.

1. Dans l’analyse, choisissez un acide aminé qui répond aux deux critères suivants :
   • Donne de bons rendements après hydrolyse et dérivatisation (par exemple, Asp, Glu, His, Arg, Ala, Pro, Leu, Phe, Lys). Gly n’est pas approprié, car il s’agit d’un contaminant de fond courant ; et
   • Peut contenir seulement quelques résidus par mole d’échantillon (sur la base de l’estimation de la masse moléculaire de l’échantillon et du rendement en acides aminés). De telles informations peuvent être obtenues à partir d’autres procédures, telles que la digestion au bromure de cyanogène, qui coupe sélectivement la chaîne polypeptidique intacte au niveau de la méthionine.
2. Sur la base de ces informations, choisissez une valeur entière pour cet acide aminé.
3. Divisez le rendement de l’acide aminé sélectionné par la valeur entière choisie pour obtenir la quantité molaire estimée d’échantillon injectée.
4. Suivez les étapes 5 et 6 de la section 7.3.2.1.
5. Vérifiez si une valeur supérieure ou une valeur inférieure vous permet d’obtenir des écarts plus petits avec les nombres entiers.

La concentration en peptides ou en protéines dans l’échantillon d’origine peut être calculée à partir de la somme des produits obtenus en multipliant la quantité en picomoles de chaque acide aminé par la masse moléculaire correspondante.

En utilisant l’exemple cité dans le tableau de la section 7.3.1, le calcul commence comme suit :

Exemple de calcul :

Pour l’Asp (asparagine) de l’échantillon – pour une quantité observée de 220 picomoles et une masse moléculaire de 133,10 g/mole, on obtient :

Ce même calcul est appliqué pour chaque acide aminé souhaité. Le tableau ci-dessous présente la quantité en picogrammes calculée pour chaque acide aminé, avec en bas à droite la somme totale des quantités de protéines injectées à partir de l’échantillon.

Dans l’analyse des produits destinés à l’alimentation humaine et animale, les valeurs calculées ci-dessus s’appliquent également. Toutefois, l’information la plus importante pour la plupart des analyses de ce type est la teneur en acides aminés limitant la croissance, tels que la méthionine et la cystéine. La valeur qui pose le plus souvent problème est le pourcentage pondéral d’acides aminés dans l’échantillon.

Pour calculer le pourcentage pondéral d’un acide aminé :

Exemple de calcul :

La quantité rapportée en pmol/µL doit être multipliée par la masse moléculaire de résidus en g/mol et par les facteurs de conversion pertinents.

La quantité rapportée en g/mol est ensuite multipliée par un éventuel facteur de dilution. Le résultat est ensuite divisé par le poids de l’échantillon, puis multiplié par 100 pour obtenir un pourcentage.

Exemple de calcul :

où :

    Amount = quantité d’acide aminé en g/mL

    Dilution = dilution de l’échantillon

Sample weight = poids en mg

Cette méthode nécessite l’utilisation d’un étalon interne.

Exemple de calcul :

La surface du pic de l’étalon interne est multipliée par le poids de l’acide aminé en mg. Celui-ci est ensuite divisé par le produit de la multiplication de la surface du pic de l’acide aminé par le poids de l’étalon interne.

où :

    RF_aa = facteur de réponse pour l’acide aminé

    P_n = surface du pic de l’étalon interne

    P_aa = surface du pic de l’acide aminé dans l’échantillon

    W_aa = poids de l’acide aminé en mg

    W_n = poids de l’étalon interne en mg

Pour calculer la teneur en pourcentage, on commence par multiplier la surface du pic de l’acide aminé par le facteur de réponse calculé. On multiplie ensuite le résultat pour le facteur d’étalon interne. On divise ensuite le résultat par le produit de la surface du pic de l’étalon interne et du poids de l’échantillon analysé. On convertit ensuite le résultat en pourcentage.

où :

    P_aa = surface du pic de l’acide aminé

    P_n = surface du pic de l’étalon interne

    RF_aa = facteur de réponse calculé

    IS = facteur d’étalon interne calculé

Exemple :

Pour un acide aminé dans un échantillon de produit alimentaire, les valeurs suivantes ont été déterminées :

    Poids de l’acide aminé (W_aa) = 0,5 mg

    Surface du pic de l’acide aminé (P_aa) = 100 000

    Surface du pic de l’étalon interne (P_n) = 110 000

    Poids de l’étalon interne (W_n) = 0,5 mg

    Poids de la prise d’essai (W_s) = 10 mg

0,5 mg x 2 x 10-2 = 0,05

L’acide aminé concerné est présent à raison de 0,9 % en poids de l’aliment.