Guide complet pour l’hydrolyse et l’analyse des acides aminés

Les produits destinés à l’alimentation humaine et animale sont constitués de composés chimiques qui contiennent des acides aminés essentiels à la croissance et à la nutrition. L’analyse de la teneur en acides aminés est importante pour garantir la qualité nutritive. Cependant, la fabrication de ces produits se fait en masse. Comme pour la production pharmaceutique, le rendement des procédés en masse peut varier au cours d’un cycle de production. Il faut donc déterminer ce qui constitue un échantillon représentatif. Cela implique généralement une stratégie de sous-échantillonnage. L’analyse des acides aminés contenus dans ces produits requiert d’adopter différentes approches afin de déterminer la composition en protéines totales. Comme les produits destinés à l’alimentation humaine et animale sont produits en masse et contiennent des constituants non protéiques, une hydrolyse liquide est recommandée.

Remarque : Les acides aminés soufrés, comme la cystéine et la méthionine, ainsi que le tryptophane ne sont pas stables dans des conditions d’hydrolyse acide standard. D’autres méthodologies peuvent être employées pour analyser efficacement ces acides aminés.

Dans cette section, nous présentons trois procédures d’hydrolyse :

• Hydrolyse acide, pour déterminer la teneur et la composition en protéines totales
• Oxydation à l’acide performique, pour mesurer les acides aminés soufrés, comme la cystéine et la méthionine
• Hydrolyse basique, pour évaluer le rendement en tryptophane

Lors de l’analyse des acides aminés liés au sein de protéines, les liaisons peptidiques doivent être rompues pour libérer les acides aminés à analyser (Figure 1). Pour les échantillons de protéines alimentaires à hydrolyser, le pH de la matière de l’échantillon et la présence de matières solides doivent être pris en compte. Comme mentionné dans les sections précédentes, la vitesse ou l’étendue de l’hydrolyse varie en fonction des acides aminés présents dans les protéines. Ceci est particulièrement vrai pour les protéines présentes dans les produits alimentaires. Comme dans toute méthode d’hydrolyse, les paramètres choisis doivent être le résultat d’une expérimentation minutieuse.

Lors de l’analyse de produits destinés à l’alimentation animale, trois facteurs doivent être pris en compte pour la préparation des échantillons :

1. Traitement des échantillons
2. Quantité d’échantillon hydrolysée
3. Volume d’acide utilisé pour l’hydrolyse

3.2.1 Traitement des échantillons

Les céréales fourragères et les échantillons similaires ne sont normalement pas homogènes. Ils doivent alors être broyés en une poudre fine de sorte à les rendre aussi homogènes que possible. Les échantillons à forte teneur en graisses peuvent être dégraissés par le biais de protocoles standard avant le broyage final. Une poudre fine permet une hydrolyse efficace des protéines présentes dans les aliments pour animaux. Selon la méthode de l’AOAC (4.1.11, 994.12b, J.AOAC Int. 88, 2005, Amino Acid Analysis of Feeds), l’échantillon test doit être broyé jusqu’à ce qu’il passe à travers un tamis de 0,25 mm ou de maille 60 (granulométrie de 250 µm).

3.2.2 Quantité d’échantillon

La méthode de l’AOAC pour l’analyse des acides aminés dans les aliments pour animaux recommande la formule suivante pour déterminer la quantité d’échantillon nécessaire.

Calculez la quantité approximative de la prise d’essai comme suit :

Ws = 1 000/Ns

où Ns = teneur en azote de la prise d’essai (en %), et Ws = poids de matière à tester équivalant à une teneur en azote de 10 mg (en mg).

En général, cette valeur se situe entre 100 et 1 000 mg de matière pour chaque échantillon analysé.

3.2.3 Volume d’acide

Comme indiqué précédemment, un important excès pondéral d’acide est nécessaire pour hydrolyser efficacement les échantillons de protéines. Les produits destinés à l’alimentation animale de dérogent pas à la règle. Toutefois, contrairement à l’excès de facteur 100 mentionné en section 2.1.2, la méthode 994.12 de l’AOAC prescrit un rapport entre le poids d’acide ajouté et le poids de l’échantillon compris entre 50 et 500. En raison de l’étendue de cette plage et de la présence de particules non protéiques en vrac dans les aliments pour animaux, vous devez réaliser des expérimentations minutieuses afin de trouver le facteur à utiliser avant l’analyse des échantillons en routine.

3.2.4 Étalons internes

L’utilisation d’un étalon interne compense au mieux la variabilité des réactions d’hydrolyse de chacun des acides aminés de l’échantillon. Waters recommande d’utiliser la norvaline (Nva) comme étalon interne pour la solution AccQ•Tag Ultra en UPLC, et l’acide alpha-aminobutyrique (AABA) ou la norleucine pour la solution AccQ•Tag en HPLC. La méthode 994.12 de l’AOAC pour l’analyse des aliments pour animaux recommande quant à elle la norleucine. Lorsque vous choisissez un étalon interne, assurez-vous qu’il permette d’obtenir les résolutions souhaitées entre les pics d’acides aminés en chromatographie.

3.2.5 Méthode 994.12 de l’AOAC pour l’analyse des acides aminés dans les produits destinés à l’alimentation animale

Les publications font état de diverses méthodes pouvant être adaptées à l’analyse des acides aminés dans les aliments pour animaux. La méthode présentée ci-après est une adaptation de la méthode 994.12 de l’AOAC pour l’analyse des acides aminés dans les produits destinés à l’alimentation animale.

• Balance analytique, précision d’affichage ±0,1 mg
• Balance à plateau supérieur
• Flacon de 50 mL, polyéthylène
• Tubes à digestion (ballons d’ébullition acceptables)
• Bloc de digestion (chauffe-ballon ou bain-marie acceptable)
• Unités de filtration, 0,22 µm (Millex GS et Millipore acceptables)
• pH-mètre, étalonné avec des tampons de pH 2,0, 4,0 et 7,0
• Condenseur à reflux
• Évaporateur rotatif
• Béchers en verre de 250 et 1 000 mL
• Fiole Erlenmeyer, 150 mL
• Ballon d’évaporation à fond rond, 1 000 mL
• Éprouvettes graduées de 100, 500 et 1 000 mL
• Fiole jaugée de 1 000 mL
• Pipettes jaugées de 10 et 20 mL
• Filtre en verre fritté, porosité 10–15 µm
• Seringues

• DL-norleucine, cristaux
• Acide chlorhydrique, concentré
• Hydroxyde de sodium, solution à 30 % (30 g/100 mL)
• Phénol, cristaux
• Thiodiglycol, solution à 98 %
• Citrate trisodique dihydraté
• Tampons de pH, pH 2,0, 4,0 et 7,0

Tampon de citrate de sodium, pH 2,20

1. Pesez 19,60 g de citrate trisodique dihydraté dans un bécher de 1 000 mL.
2. Dissolvez dans environ 800 mL d’H₂O.
3. Tout en agitant, ajoutez 10 mL de solution de thiodiglycol à 98 % et 15 mL de HCl.
4. Transvasez la totalité de la solution dans une fiole jaugée de 1 000 mL et complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O.
5. Filtrez la solution tampon sur un filtre en verre fritté.
6. Ajustez le pH à 2,20 avec du HCl ou du NaOH 2 M.

Solution de phénol-HCl 6 M

1. Pesez 1 g de cristaux de phénol dans un bécher de 1 000 mL taré.
2. Dissolvez les cristaux dans 500 mL d’H₂O. Tout en agitant, ajoutez lentement 500 mL de HCl.

Solution d’acide chlorhydrique, 1 M

1. Versez environ 800 mL d’H₂O dans une fiole jaugée de 1 000 mL.
2. Ajoutez 83,3 mL de HCl à l’aide d’une pipette.
3. Complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O et mélangez vigoureusement.

Solution d’acide chlorhydrique, 0,1 M

1. Versez environ 800 mL d’H₂O dans une fiole jaugée de 1 000 mL.
2. Ajoutez 100 mL de HCl 1 M à l’aide d’une pipette.
3. Complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O et mélangez vigoureusement.

Solution d’hydroxyde de sodium (NaOH 2 M)

1. Pesez 80,0 g de NaOH dans un bécher de 1 000 mL taré.
2. Dissolvez lentement les pastilles dans un bécher dans environ 600 mL d’H₂O.
3. Refroidissez la solution et transvasez-la en totalité dans une fiole jaugée de 1 000 mL.
4. Complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O et mélangez vigoureusement.

Solution d’étalon interne

1. Pesez avec exactitude 195 à 200 mg de cristaux de DL-norleucine dans un Erlenmeyer de 150 mL taré.
2. Dissolvez avec 100 mL de HCl 1 M.
3. Transvasez la totalité de la solution dans une fiole jaugée de 1 000 mL et complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O.

1. Pesez précisément 100 à 1 000 mg d’échantillon test finement broyé à 0,1 mg près (équivalant à env. 10 mg d’azote) dans des tubes à digestion étiquetés. Utilisez le calcul décrit dans la section ci-dessus pour déterminer la quantité réelle d’échantillon à utiliser.
2. Ajoutez 50 mL de solution de phénol-HCl 6 M à la portion pesée et agitez brièvement. Ajoutez 2 à 3 pierres d’ébullition à la solution.
3. Sous une hotte aspirante, hydrolysez à reflux pendant 24 h entre 110 et 120 °C à l’aide d’un bloc chauffant ou d’un bain-marie dont la température est équilibrée.
4. Retirez les tubes à digestion du four et laissez-les revenir à température ambiante.
5. Ajoutez 20 mL de la solution d’étalon interne de norleucine dans chaque solution test à l’aide d’une pipette jaugée. Mélangez les solutions en agitant les flacons.
6. Filtrez les hydrolysats sur un filtre en verre fritté dans des ballons d’évaporation à fond rond de 1 000 mL étiquetés.
7. Installez chaque flacon sur un évaporateur rotatif et évaporez-les à 60 °C jusqu’à siccité.
8. Lavez en ajoutant environ 20 mL d’H₂O et répétez l’évaporation. Répétez deux fois les étapes de lavage et d’évaporation.
9. Retirez le flacon de l’évaporateur.
10. Ajoutez 50 mL de tampon de citrate de sodium à l’hydrolysat évaporé, mélangez bien et transvasez dans un flacon en polyéthylène de 50 mL étiqueté.
11. L’échantillon peut maintenant être préparé en vue de la dérivatisation.

La cystéine et la méthionine sont des acides aminés critiques dans l’analyse des produits destinés à l’alimentation animale, car tous deux ont effet de limiter la croissance des animaux. Les conditions standard d’hydrolyse acide n’étant pas adaptées à ces acides aminés, on procède généralement à une oxydation à l’acide performique. Cette technique convertit la cystéine et la cystine en acide cyanurique, et la méthionine en sulfone de méthionine (Figure 3). Les échantillons peuvent ensuite être soumis efficacement à une hydrolyse acide et à une dérivatisation.

Les publications décrivent diverses versions de l’oxydation à l’acide performique. Bien que les processus globaux soient similaires, leurs caractéristiques diffèrent. Ce manuel présente deux protocoles faisant office de points de départ. La première méthode provient de la méthode 994.12 de l’AOAC. La seconde est une méthode alternative d’après MacDonald et al, 1985. Veillez à évaluer et optimiser minutieusement une approche avant de l’adopter.

• Balance analytique, précision d’affichage ±0,1 mg
• Balance à plateau supérieur
• Flacon de 50 mL, polyéthylène
• Tubes à digestion (ballons d’ébullition acceptables)
• Bloc de digestion (chauffe-ballon ou bain-marie acceptable)
• Unités de filtration, 0,22 µm (Millex GS et Millipore acceptables)
• pH-mètre, étalonné avec des tampons de pH 2,0, 4,0 et 7,0
• Condenseur à reflux
• Évaporateur rotatif
• Béchers en verre de 250 et 1 000 mL
• Fiole Erlenmeyer, 150 mL
• Ballon d’évaporation à fond rond, 1 000 mL
• Éprouvettes graduées de 100, 500 et 1 000 mL
• Fiole jaugée de 1 000 mL
• Pipettes jaugées de 10 et 20 mL
• Filtre en verre fritté, porosité 10–15 µm
• Bain de glace
• Seringues

• Acide formique à 88 %
• Peroxyde d’hydrogène à 30 %
• Métabisulfite de sodium
• DL-norleucine, cristaux
• Acide chlorhydrique, concentré
• Hydroxyde de sodium, solution à 30 % (30 g/100 mL)
• Phénol, cristaux
• Thiodiglycol, solution à 98 %
• Citrate trisodique dihydraté
• Tampon de pH, pH 2,0, 4,0 et 7,0

Tampon de citrate de sodium, pH 2,20

1. Pesez 19,60 g de citrate trisodique dihydraté dans un bécher de 1 000 mL.
2. Dissolvez dans environ 800 mL d’H₂O.
3. Tout en agitant, ajoutez 10 mL de solution de thiodiglycol à 98 % et 15 mL de HCl.
4. Transvasez la totalité de la solution dans une fiole jaugée de 1 000 mL et complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O.
5. Filtrez la solution tampon sur un filtre en verre fritté.
6. Ajustez le pH à 2,20 avec du HCl ou du NaOH 2 M.

Solution de phénol-HCl 6 M

1. Pesez 1 g de cristaux de phénol dans un bécher de 1 000 mL taré.
2. Dissolvez les cristaux dans 500 mL d’H₂O. Tout en agitant, ajoutez lentement 500 mL de HCl.

Solution d’acide chlorhydrique, 1 M

1. Versez environ 800 mL d’H₂O dans une fiole jaugée de 1 000 mL.
2. Ajoutez 83,3 mL de HCl à l’aide d’une pipette.
3. Complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O et mélangez vigoureusement.

Solution d’acide chlorhydrique, 0,1 M

1. Versez environ 800 mL d’H₂O dans une fiole jaugée de 1 000 mL.
2. Ajoutez 100 mL de HCl 1 M à l’aide d’une pipette.
3. Complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O et mélangez vigoureusement.

Solution d’hydroxyde de sodium (NaOH 2 M)

1. Pesez 80,0 g de NaOH dans un bécher de 1 000 mL taré.
2. Dissolvez lentement les pastilles dans un bécher dans environ 600 mL d’H₂O.
3. Refroidissez la solution et transvasez-la en totalité dans une fiole jaugée de 1 000 mL.
4. Complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O et mélangez vigoureusement.

Solution d’étalon interne

1. Pesez avec exactitude 195 à 200 mg de cristaux de DL-norleucine dans un Erlenmeyer de 150 mL taré.
2. Dissolvez avec 100 mL de HCl 1 M. Transvasez la totalité de la solution dans une fiole jaugée de 1 000 mL et complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O.

Réactif à l’acide performique

1. Préparez la solution sous une hotte. Pesez 25 mg de cristaux de phénol dans un tube à essai de 25 mL.
2. Ajoutez 0,5 mL de H₂O₂ à 30 % à l’aide d’une micropipette.
3. Ajoutez 4,5 mL de solution d’acide formique à 88 %.
4. Recouvrez le tube à essai d’un bouchon et laissez reposer le mélange 30 minutes à température ambiante.
5. Au bout de 30 minutes, placez les tubes à essai dans un bain de glace et refroidissez le mélange d’acide performique pendant 15 minutes.
6. Préparez le réactif juste avant son utilisation.

1. Pesez précisément 100 à 1 000 mg d’échantillon test finement broyé, à 0,1 mg près (équivalent à une teneur en azote d’environ 10 mg), dans des tubes à hydrolyse étiquetés. Utilisez le calcul décrit précédemment pour déterminer la quantité réelle d’échantillon à utiliser.
2. Placez un agitateur magnétique dans chaque tube et plongez les tubes à digestion dans un bain de glace (0 °C).
3. Une fois que l’acide performique et la prise d’essai ont refroidi au moins 15 minutes, ajoutez 5 mL de réactif à l’acide performique dans chaque tube à digestion. Bouchez ou recouvrez tous les tubes et agitez-les pendant 15 minutes.
4. Replacez les tubes à digestion dans le bain de glace et laissez les échantillons s’oxyder pendant 16 heures.
5. Retirez les bouchons de verre et ajoutez environ 0,84 g de métabisulfite de sodium pour décomposer l’acide performique. Agitez pendant 15 minutes pour libérer le SO₂.
6. L’échantillon est maintenant prêt pour l’étape d’hydrolyse acide.

1. Ajoutez 50 mL de solution de phénol - HCl 6 N à la portion pesée et agitez brièvement. Ajoutez 2 à 3 pierres d’ébullition à la solution.
2. Sous une hotte aspirante, hydrolysez à reflux pendant 24 heures entre 110 et 120 °C à l’aide d’un bloc chauffant ou un bain-marie dont la température est équilibrée.
3. Retirez les tubes à digestion du four et laissez-les revenir à température ambiante.
4. Ajoutez 20 mL de la solution d’étalon interne de norleucine dans chaque solution test à l’aide d’une pipette jaugée. Mélangez les solutions en agitant les flacons.
5. Passez aux étapes (a–d) ou (e–g) ci-dessous.
   1. Filtrez les hydrolysats sur un filtre en verre fritté dans des ballons d’évaporation à fond rond de 1 000 mL étiquetés.
   2. Installez chaque flacon sur un évaporateur rotatif et évaporez-les sous vide à 40 °C jusqu’à obtenir environ 0,5 mL. Remarque : ne laissez pas la solution s’évaporer jusqu’à siccité.
   3. Retirez le flacon de l’évaporateur.
   4. Ajoutez 50 mL de tampon de citrate de sodium à l’hydrolysat évaporé, mélangez bien et transvasez dans un flacon en polyéthylène de 50 mL étiqueté.
   5. Filtrez les hydrolysats dans un flacon à vide de 250 mL à travers un filtre en verre fritté, puis transférez le filtrat dans un bécher de 250 mL.
   6. Placez le bécher dans un bain de glace.
   7. Neutralisez partiellement les hydrolysats avec environ 40 mL de NaOH 7,5 M, tout en agitant. (Remarque : la température ne peut pas dépasser 40 °C.) Ajustez le pH à 2,20 avec du NaOH 2 M.

     6. L’échantillon peut maintenant être préparé en vue de la dérivatisation.

Remarque : Cet essai a été cité dans de nombreuses publications. Aucune ne s’accorde sur les quantités d’acide performique et de bromure d’hydrogène ni sur la température d’évaporation. Ces paramètres affecteront le temps d’évaporation à l’étape 7.

• Tubes de 25 x 150 mm avec bouchons
• Glace et bain de glace
• Pipettes jaugées
• Évaporateur sous vide
• Source d’azote propre
• Four ou bloc chauffant
• Verrerie jaugée
• Acide performique
• Peroxyde d’hydrogène
• Acide formique
• Eau ultra-pure
• Solution d’HBr à 48 % en poids

1. Ajoutez un volume de peroxyde d’hydrogène à 30 % à neuf volumes d’acide formique à 88 %.
2. Laissez reposer le mélange pendant une heure en le remuant fréquemment.
3. Placez le mélange dans un bain de glace pendant 30 minutes, puis utilisez-le immédiatement.

1. Pesez les échantillons correspondant à environ 20 mg de protéines (au mg près) dans des tubes de 25 x 150 mm.
2. Placez les échantillons dans un bain de glace pendant 30 minutes.
3. Ajoutez 10 mL d’acide performique froid aux échantillons, remuez-les délicatement et bouchez-les avec un bouchon revêtu de Téflon.
4. Conservez les échantillons (toujours dans beaucoup de glace) à 0 °C pendant une nuit (16 heures) au réfrigérateur.
5. Au bout de 16 heures, les échantillons étant toujours à 0 °C, ajoutez 3 gouttes d’octanol, puis 3 mL d’HBr à 48 % réfrigéré, en agitant lentement les échantillons. Effectuez cette étape sous une hotte. Laissez les échantillons reposer à 0 °C pendant 30 minutes.
6. Évaporez avec un évaporateur sous vide à 37 °C jusqu’à siccité. Cette opération dure 1 à 2 heures.
7. Ajoutez 5 mL de HCI 6 N dans les tubes. Purgez à l’azote pendant 30 secondes, puis bouchez immédiatement.
8. Placez les échantillons dans un four à 110 °C pendant 24 heures.
9. Retirez-les du four et laissez-les refroidir.
10. Ajoutez 10 mL d’étalon interne de travail, 5,0 µmol/mL, et mélangez bien. Remarque : la concentration réelle de l’étalon interne utilisée doit être calculée de sorte à obtenir la même quantité lors de l’injection sur l’instrument.
11. Transvasez les échantillons dans des fioles jaugées de 250 mL, en rinçant les tubes d’échantillon avec de l’eau de qualité HPLC et en complétant les fioles jusqu’au repère avec les solutions de lavage.
12. Filtrez environ 1 mL des échantillons de l’étape 12 sur un filtre à échantillon de 0,45 µm. Si la dérivatisation n’est pas réalisée immédiatement, conservez les échantillons bouchés au congélateur. Remarque : la centrifugation peut remplacer cette étape de filtration. Centrifugez jusqu’à obtenir un surnageant limpide.

En conditions standard d’hydrolyse acide, le tryptophane (Trp) est instable et ne peut être analysé efficacement. L’hydrolyse basique est proposée comme méthode alternative pour la libération et l’analyse de cet acide aminé dans les aliments pour animaux. Cette méthode utilise du NaOH 4,2 M pour hydrolyser la protéine. Elle présente l’avantage de ne nécessiter aucune étape de dérivatisation. Une analyse instrumentale par détection UV à 280 nm suffit.

Le protocole présenté ici est une adaptation de la méthode 988.15 de l’AOAC pour l’analyse du tryptophane dans les produits et ingrédients destinés à l’alimentation humaine et animale.

• Ballons micro-Kjeldahl modifiés (disponibles auprès d’Ace Glass, Inc.) – Ballons micro-Kjeldahl de 25 mL avec col de 15 cm de long et 12 mm de diamètre interne. Le col se contracte jusqu’à environ 6 mm de diamètre interne, 5 cm au-dessus du bulbe du flacon.
• Pompe à vide
• Dispositif de filtration à membrane et filtres de 0,45 µm
• Neige carbonique
• Bain-marie
• Éthanol pour bain-marie
• Pipettes jaugées et verrerie
• pH-mètre

• Eau purifiée par le système Milli-Q (Millipore Corp.) ou équivalent
• NaOH 4,2 M
• 1-octanol
• Solution tampon de citrate de sodium à pH 4,25
• HCl
• Solution étalon de tryptophane
  • Solution mère – 1 mg/mL. Dissolvez 250 mg de L-tryptophane dans 100 mL d’H₂O avec six gouttes de HCl. Diluez avec de l’H₂O jusqu’à obtenir 250 mL.
  • Solution de travail I – 0,1 mg/mL. Diluez 10 mL de solution mère avec de l’H₂O jusqu’à obtenir 100 mL.
  • Solution de travail II – 0,04 mg/mL. Diluez 4 mL de solution mère avec de l’H₂O jusqu’à obtenir 100 mL.
  • Réfrigérez les solutions étalons lorsqu’elles ne sont pas utilisées. Préparez des solutions fraîches tous les mois.

1. Broyez l’échantillon de laboratoire dans un broyeur centrifuge muni d’un tamis de 1 mm. Mélangez bien.
2. Pesez une prise d’essai contenant 100 mg de protéine dans ballon micro-Kjeldahl modifié.
3. Pour les échantillons tests contenant plus de 5 % de lipides :
   1. Ajoutez 10 mL d’éther de pétrole à la prise d’essai pesée dans le flacon.
   2. Agitez doucement pour mélanger et traitez aux ultrasons pendant 20 minutes. Laissez décanter. Centrifugez si nécessaire.
   3. Siphonnez autant d’éther de pétrole que possible, en veillant à ne pas éliminer de matières solides.
   4. Évaporez l’éther de pétrole restant sous un léger jet de N₂. Passez à l’étape d’hydrolyse.
4. Pour les échantillons tests contenant moins de 5 % de lipides : passez à l’étape d’hydrolyse.

1. Dégazez la solution de NaOH 4,2 M en la faisant barboter avec du N₂ pendant 10 minutes.
2. Ajoutez 10 mL de NaOH 4,2 M dégazé dans chaque ballon.
3. Ajoutez trois gouttes de 1-octanol.
4. Congelez immédiatement la solution traitée dans un bain de neige carbonique/éthanol. Retirez ensuite le ballon du bain et évacuez jusqu’à 10 mm.
5. Coupez le vide et fermez les ballons.
6. Placez le ballon scellé dans un bécher contenant de l’H₂O à température ambiante jusqu’à ce que la solution test fonde.
7. Placez le ballon dans un four à 110 °C pendant 20 heures.
8. Laissez les ballons refroidir à température ambiante.
9. Rincez le col du ballon avec 1 mL de solution tampon de citrate de sodium à pH 4,25, en recueillant le la solution de rinçage dans un bécher.
10. Transvasez la totalité de l’hydrolysat dans le même bécher de 50 mL, en rinçant le flacon avec deux portions de solution tampon de citrate de sodium à pH 4,25.
11. Neutralisez la solution avec 3,5 mL de HCl et agitez vigoureusement. Ajustez le pH à 4,25 ± 0,05.
12. Transvasez la totalité de la solution dans une fiole jaugée de 25 mL et complétez jusqu’au repère avec de l’H₂O.
13. Versez la solution dans un tube à centrifugation de 40 mL et centrifugez pendant 20 minutes à 1 150 G.
14. Filtrez le surnageant sur papier filtre en fibre verre (Whatman GF/A).
15. Transférez le filtrat dans un tube à centrifugation et centrifugez pendant 10 minutes à 23 000 G.

Remarque : À ce stade, vous pouvez prélever une aliquote du surnageant pour une analyse UV (289 nm), sans dérivatisation.