Quando um método estabelecido é utilizado para analisar um lote de amostras, ocasionalmente, o formato de pico pode mudar ao longo de uma série de injeções. Isso pode fazer com que os fatores de cauda não atendam ao requisito. Existem várias causas possíveis para esse problema, incluindo problemas com o sistema HPLC, a fase móvel, a amostra e a coluna [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385-420]. Ao solucionar problemas, um bom ponto de partida é analisar cuidadosamente os cromatogramas para observar se a alteração no formato de pico é vista em todos os picos ou apenas em alguns deles. Nesse último caso, observe as propriedades dos analitos cujos picos foram alterados e verifique como eles diferem daqueles dos analitos cujos picos não foram alterados. Os analitos problemáticos são básicos ou ácidos, enquanto os outros não são? Se forem, a causa poderá ser uma mudança na carga de superfície da fase estacionária ou uma mudança no pH da fase móvel. Se os analitos mostrando a alteração no formato de pico forem básicos enquanto os outros não forem, uma causa raiz provável nos métodos de fase reversa é a perda de grupos de capeamento a partir da fase estacionária, o que aumenta a concentração de grupos silanol. Grupos silanol ionizados na partícula de base são uma causa comum de cauda de pico para analitos básicos [D. V. McCalley, Chem. Comm. 59 (2023), pp. 7887-7899].
No caso em que todos os picos de um cromatograma mostram alterações semelhantes no seu formato, uma causa possível pode ser o deslizamento da tubulação que conecta a coluna ao sistema HPLC. Isso pode acontecer ao utilizar conexões de PEEK de aperto com os dedos. Outra causa possível é a presença de um vazio na coluna, que pode ocorrer quando uma coluna é exposta a mudanças rápidas de pressão ou é utilizada sob condições de pH e/ou temperatura que resultam em hidrólise das partículas de suporte da fase estacionária. Isso é comum quando colunas à base de sílica são utilizadas com fases móveis básicas (pH > 7), especialmente a temperaturas elevadas (> 30 °C) [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995), pp. 3–19., H. A. Claessens, M. A. van Straten, J. J. Kirkland, J. Chromatogr. A 728 (1996), pp. 259-270]. Uma terceira causa possível é o acúmulo de constituintes da matriz da amostra no sistema HPLC e/ou na coluna. Muitas amostras têm componentes que podem precipitar ou adsorver fortemente nas superfícies do sistema e da coluna, como proteínas, lipídios, polissacarídeos e tensoativos. Quando esses componentes se acumulam nas superfícies do sistema e/ou da coluna, eles podem interromper a distribuição de fluxo, resultando em alterações no formato para todos os picos.
Analise os cromatogramas mostrados na Figura 2. O cromatograma inicial mostra 5 picos com bons fatores de cauda, variando de 1,01 a 1,09. Após 200 injeções de amostras, o cromatograma agora exibe que todos os 5 picos apresentam um aumento nos fatores de cauda, variando de 1,61 a 1,97. A contrapressão da coluna mostrava apenas um pequeno aumento (3,5%) ao longo das 200 injeções.
