Alterações no formato de pico com o aumento do volume de injeção

Conforme discutido nesta série, as alterações no formato de pico são um problema comum em análises de HPLC. O ideal é que os picos sejam simétricos, com uma forma gaussiana [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353–362]. A simetria de um pico pode ser quantificada por meio do cálculo do fator de cauda (T) conforme a USP, como ilustrado na Figura 1. Um fator de cauda de 1 indica simetria perfeita, enquanto valores menores que 1 são denominados frontais, e valores maiores que 1 são denominados de cauda. Muitos métodos exigem que os fatores de cauda para todos os picos estejam dentro de um intervalo especificado. Os fatores de cauda que se desviam significativamente de 1 podem diminuir a resolução de picos que eluem próximos uns dos outros, tornando a integração mais difícil [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353–362]. Além disso, quando a simetria do pico é ruim, ele geralmente é mais largo do que deveria ser, o que diminui sua altura. Em aplicações que envolvam detecção e quantificação de analitos presentes em baixas concentrações, isso pode diminuir a precisão dos resultados, bem como os limites de quantificação e detecção.

Uma etapa importante ao desenvolver métodos para quantificar analitos presentes em baixas concentrações é otimizar o volume de injeção. De preferência, as alturas e as áreas de pico aumentam linearmente com o volume de injeção para uma composição de amostra fixa até que a massa, o volume ou a sobrecarga do detector comecem a ocorrer [U. D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997, pp. 355-356]. No exemplo mostrado na Figura 2A, uma mistura de seis analitos, cada um na concentração de 0,2 µg/mL, foi separada utilizando um gradiente de acetonitrila de 5 a 95%. O volume de injeção era de 2 µL, e uma coluna de 2,1 x 50 mm foi utilizada; então, o volume de injeção foi 1,1% do volume da coluna. Como a orientação geral é de que o volume de injeção deve ser de 1 a 10% do volume da coluna [Base de conhecimento da Waters 48961], parecia haver espaço para elevar o volume de injeção de modo a aumentar as relações sinal-ruído. Quando o volume de injeção foi aumentado para 4 µL, o cromatograma mostrado na Figura 2B foi obtido. Enquanto as áreas de todos os seis picos aumentaram a um fator de dois, como esperado, os dois primeiros picos não aumentaram em altura, mas ficaram mais largos com a frente acentuada.

Conforme discutido nas duas primeiras partes, existem várias causas possíveis para alterações na simetria de pico, incluindo problemas com o sistema HPLC, a fase móvel, a amostra e a coluna [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385-420]. Como discutido anteriormente, um bom ponto de partida para a solução de problemas é analisar cuidadosamente os cromatogramas para observar se a alteração no formato de pico é vista em todos os picos ou apenas em alguns deles. Quando apenas alguns picos em um cromatograma mostram picos frontais, como na Figura 2B, as causas possíveis incluem coeluição de um composto interferente, sobrecarga de massa e utilização de um solvente de amostra demasiadamente forte. Como o problema foi observado após o aumento do volume de injeção e as concentrações de analito são baixas, esta última causa parece a mais provável. O solvente da amostra utilizado para os cromatogramas mostrados na Figura 2A e 2B foi acetonitrila/água na proporção de 50/50 v/v. Esse solvente foi escolhido porque alguns dos analitos têm uma solubilidade limitada em água. Como o gradiente começa com uma concentração de acetonitrila de apenas 5%, o solvente da amostra é consideravelmente mais forte do que a fase móvel inicial. Como os primeiros analitos a eluir são os menos hidrofóbicos, eles são mais afetados pelo solvente forte da amostra. Para testar essa hipótese, uma série de amostras foi preparada com as mesmas concentrações de analito, mas com diferentes proporções de acetonitrila/água. Os resultados do fator de cauda para os dois primeiros picos são mostrados na Figura 3. Os fatores de cauda para ambos os analitos diminuem à medida que a concentração de acetonitrila é aumentada, demonstrando que a utilização de um solvente de amostra forte é a causa dos picos frontais observados na Figura 2B. Para evitar esse problema e, ao mesmo tempo, garantir que os analitos mais hidrofóbicos sejam dissolvidos, foi escolhida uma concentração de acetonitrila de 10%. O cromatograma resultante da injeção de 4 µL de uma amostra dissolvida em acetonitrila/água na proporção de 10/90 v/v é mostrado na Figura 2C. Agora, todos os picos mostram o aumento esperado de duas vezes na altura em comparação com a injeção de 2 µL, com boa simetria de pico. Ao otimizar o volume de injeção, a força do solvente da amostra em relação à composição inicial da fase móvel deve sempre ser considerada.