Alterações no formato de pico em uma coluna previamente utilizada

Conforme discutido nesta série, as alterações no formato de pico são um problema comum em análises de HPLC. O ideal é que os picos sejam simétricos, com uma forma gaussiana [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353–362]. A simetria de um pico pode ser quantificada por meio do cálculo do fator de cauda (T) conforme a USP, como ilustrado na Figura 1. Um fator de cauda de 1 indica simetria perfeita, enquanto valores menores que 1 são denominados frontais, e valores maiores que 1 são denominados de cauda. Muitos métodos exigem que os fatores de cauda para todos os picos estejam dentro de um intervalo especificado. Os fatores de cauda que se desviam significativamente de 1 podem diminuir a resolução de picos que eluem próximos uns dos outros, tornando a integração mais difícil [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353–362].

Ao configurar para executar um método estabelecido em uma coluna previamente utilizada, um teste de adequação deve ser realizado para verificar se a coluna está em boas condições. Este teste deve avaliar a capacidade da coluna e do sistema de produzir uma pressão aceitável, tempos de retenção, áreas de pico, larguras de pico e simetria de pico. Uma alteração significativa em qualquer uma dessas respostas em relação aos resultados obtidos anteriormente na coluna pode indicar um problema com ela. Um exemplo é mostrado na Figura 2, que empregava o Material de referência para CQ de fase reversa da Waters (PN: 186006363). Esse material de referência, que contém sete compostos, foi analisado utilizando um método de gradiente. Inicialmente (Figura 2A), os fatores de cauda conforme a USP variavam de 0,90 a 1,27, em um intervalo aceitável. Após a coluna ser removida do sistema e depois reconectada, o mesmo método de teste foi realizado, produzindo o cromatograma exibido na Figura 2B. Embora os tempos de retenção, as áreas de pico e a pressão da coluna fossem semelhantes aos resultados iniciais, os fatores de cauda conforme a USP para todos os sete picos foram mais altos, variando de 1,32 a 1,65.

Conforme discutido na primeira parte, existem várias causas possíveis para alterações na simetria de pico, incluindo problemas com o sistema HPLC, a fase móvel, a amostra e a coluna [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385–420]. Como discutido anteriormente, um bom ponto de partida para a solução de problemas é analisar cuidadosamente os cromatogramas para observar se a alteração no formato de pico é vista em todos os picos ou apenas em alguns deles. Quando todos os picos em um cromatograma mostram alterações semelhantes no formato de pico, como na Figura 2B, entre as causas possíveis estão a presença de um vazio na coluna, acúmulo de constituintes da matriz da amostra na coluna ou uma conexão inadequada da coluna com o sistema HPLC. Como o problema não havia sido observado ao utilizar a coluna anteriormente, é improvável que a coluna tivesse um vazio ou um acúmulo de matriz da amostra. Isso deixa uma conexão de baixa qualidade com o sistema HPLC como a causa mais provável. As conexões da coluna foram recolocadas, e o método de teste de adequação foi realizado novamente. Como mostrado na Figura 2C, os fatores de cauda conforme a USP foram restaurados para os valores iniciais. Isso confirma que o problema foi causado por uma conexão incorreta da coluna, causando um espaço entre a coluna e a tubulação que a conecta ao sistema (veja a Figura 3). Mesmo um pequeno espaço é suficiente para causar distorção do formato de pico. Para demonstrações de como conectar colunas com diferentes tipos de conexões de extremidade a vários sistemas HPLC, confira a série de vídeos nesta URL: How to Connect HPLC Columns to Waters LC Systems (Como conectar colunas de HPLC a sistemas LC da Waters)