Guia para iniciantes em SPE

SPE é cromatografia

Lembre-se de que a extração em fase sólida tem a mesma base fundamental que a HPLC. Qualquer conhecimento do comportamento cromatográfico dos analitos de interesse e de outros componentes da matriz pode ajudar na escolha do sorvente e dos eluentes adequados. Se, por exemplo, você souber que determinadas condições cromatográficas proporcionam uma excelente separação do analito das interferências, será possível escolher uma combinação semelhante de solvente e sorvente de SPE. Da mesma forma, se estiver tentando remover uma interferência que coelua em HPLC, sabe-se a priori que condições de SPE semelhantes não serão bem-sucedidas.

Protocolos gerais de eluição

Existem duas estratégias gerais para isolar e limpar componentes da amostra de interesse:

• Adsorver interferências da matriz enquanto os componentes de interesse passam através do cartucho sem serem retidos.
• Adsorver os componentes de interesse enquanto as interferências da matriz passam através do cartucho sem serem retidas.

A primeira estratégia geralmente é escolhida quando o componente de amostra desejado está presente em alta concentração. Quando os componentes de interesse estão presentes em níveis baixos, ou vários componentes de polaridades amplamente diferentes precisam ser isolados, a segunda estratégia é geralmente empregada. O enriquecimento de traços de compostos presentes em níveis extremamente baixos e a concentração de amostras diluídas também são alcançados pela segunda estratégia.

Etapas de um procedimento de extração em fase sólida

A seção a seguir descreve as etapas envolvidas em um procedimento completo de extração em fase sólida. Em muitas aplicações, uma ou mais das etapas, listadas abaixo e subsequentemente descritas por exemplos gerais, podem ser omitidas, simplificando, assim, o procedimento. Os procedimentos ilustrados aqui utilizam amostras contendo corantes para que as separações possam ser facilmente visualizadas. Lembre-se de que a maioria das amostras contém componentes incolores que exigem algum tipo de detector ou teste para localizá-los nas frações coletadas. Utilize as informações a seguir como orientação no desenvolvimento de seu próprio procedimento ou ao modificar procedimentos publicados na literatura.

1. Pré-tratamento da amostra
2. Condicionamento do cartucho
3. Carregamento da amostra
4. Eluição das frações

Cromatografia de fase normal

Este modo é utilizado classicamente para separar compostos orgânicos neutros cuja natureza química varia de hidrofóbica a moderadamente polar.

Para realizar cromatografia de fase normal com cartuchos de SPE, utilize um gradiente em etapas de solventes não polares com um material de retenção polar.

1. Condicione o cartucho com seis a dez volumes de retenção de solvente não polar, normalmente o mesmo solvente em que a amostra está dissolvida.
2. Carregue a solução de amostra no leito do cartucho.
3. Elua componentes indesejados com um solvente não polar.
4. Elua o primeiro componente de interesse com um solvente mais polar.
5. Elua os componentes restantes de interesse com solventes progressivamente mais polares (mais fortes).
6. Ao recuperar todos os componentes, descarte o cartucho utilizado de maneira segura e adequada.

Esse procedimento é ilustrado na figura abaixo para uma amostra contendo uma mistura de três corantes orgânicos neutros e relativamente não polares (amarelo, vermelho e azul) que aparece preta quando carregada inicialmente no leito do cartucho.

Ilustração de um protocolo de eluição geral para cromatografia de fase normal em cartuchos de SPE
(Sílica, Florisil, Alumina, Diol, CN, NH₂)

Cromatografia de fase reversa

Devido à multiplicidade de amostras aquosas que abrangem uma variedade de aplicações, desde água ambiental a frutas e vegetais, desde bebidas a fluidos biológicos, a cromatografia de fase reversa se tornou o modo predominante de SPE.

Para realizar cromatografia de fase reversa com cartuchos de SPE, utilize um gradiente de solventes fortemente a fracamente polares (de força de eluição de solvente fraca a forte) com um material de retenção não polar.

1. Dissolva a fase ligada a sílica ou o preenchimento de polímero com seis a dez volumes de retenção de metanol ou acetonitrila. Lave o cartucho com seis a dez volumes de retenção de água ou tampão. Não deixe o cartucho secar (a menos que esteja utilizando HLB).
2. Carregue a amostra dissolvida em um solvente fortemente polar (fraco) (normalmente água).
3. Elua componentes indesejados com um solvente fortemente polar.
4. Elua os componentes de interesse fracamente retidos com um solvente menos polar.
5. Elua componentes ligados de forma mais firme com solventes progressivamente mais não polares (mais fortes).
6. Ao recuperar todos os componentes de interesse, descarte o cartucho utilizado de maneira segura e adequada.

Esse procedimento é ilustrado na figura abaixo para uma amostra de uma bebida de uva aquosa contendo dois corantes alimentares polares (vermelho e azul), bem como açúcar e sabor artificial (mas sem suco de uva real!). Quando preparada, essa bebida aparece roxa-clara em um copo, uma vez que a concentração de corante é diluída. Quando uma porção é carregada em um cartucho de SPE preparado, os corantes fortemente retidos ficam concentrados perto da entrada em uma faixa roxa escura.

Ilustração de um protocolo de eluição geral para cromatografia de fase reversa em cartuchos de SPE
(C₁₈, tC₁₈, C₈, CN, Diol, HLB, Porapak RDX, NH₂)

Cromatografia de troca iônica

Os compostos que são iônicos ou ionizáveis são geralmente mais bem isolados por meio de alguma forma de cromatografia de troca iônica. Esse modo de separação é ortogonal aos modos de fase normal e de fase reversa mais utilizados e fornece uma segunda dimensão seletiva e eficiente para os protocolos de preparo de amostras.

Ilustração dos dois principais tipos de fases — troca de ânions e cátions —
e como eles atraem e retêm seletivamente moléculas de carga oposta

Para realizar a cromatografia de troca iônica com cartuchos de SPE, utilize um gradiente de pH ou força iônica com um material de retenção de troca iônica.

1. Condicione o cartucho com seis a dez volumes de retenção de água deionizada ou tampão fraco.
2. Carregue a amostra dissolvida em uma solução de água deionizada ou tampão.
3. Elua componentes indesejados fracamente ligados com um tampão fraco.
4. Elua o primeiro componente de interesse com um tampão mais forte (altere o pH ou a força iônica).
5. Elua outros componentes com tampões progressivamente mais fortes.
6. Ao recuperar todos os componentes, descarte o cartucho utilizado de maneira adequada.

Esse procedimento é ilustrado na figura abaixo para uma amostra de uma mistura aquosa de dois corantes iônicos com diferentes valores de pK_a. Quando carregados no cartucho, ambos são fortemente retidos, e a combinação dos componentes azul e amarelo aparece como uma faixa verde perto da entrada.

Ilustração do protocolo geral de eluição para cromatografia de troca iônica em cartuchos de SPE
(NH₂, Accell™ Plus QMA, Accell Plus CM, SCX, SAX, WCX, WAX)

Os trocadores de cátions e ânions são mais categorizados como trocadores fracos ou fortes, dependendo do tipo de grupo iônico em sua superfície. Os trocadores de cátions fortes possuem uma porção de superfície ácida, como um ácido sulfônico, que está sempre ionizado (carregado negativamente) em toda a faixa de pH. Trocadores de cátions fracos possuem uma porção de superfície ácida, como um ácido carboxílico que é carregado negativamente em pH alto, mas neutro em pH baixo. Da mesma forma, os trocadores de ânions fortes normalmente carregam grupos de amônio quaternário que são sempre carregados positivamente, enquanto os trocadores de ânions fracos possuem grupos de amina primários, secundários ou terciários que podem ser carregados positivamente em pH baixo, mas neutros em pH alto.

Utilize a tabela a seguir como orientação para escolher o tipo de cartucho de troca iônica de SPE apropriado para seu analito específico.

A cromatografia de troca iônica de modo misto combina a utilização dos modos de fase reversa e de troca iônica em um único protocolo em um único cartucho de SPE. Ela pode ser utilizada para isolar e separar compostos neutros, ácidos e básicos de uma única matriz complexa. Um substrato sorvente de SPE de modo misto ideal permanece umedecido em água enquanto exibe uma forte retenção de fase reversa de compostos hidrofóbicos. Em sua superfície existem funcionalidades de troca iônica de um dos quatro tipos gerais descritos acima. Lavagens intermediárias com misturas de solventes orgânicos de força de eluição apropriada podem ser utilizadas para isolar compostos neutros (incluindo analitos ionizáveis em seu estado neutro). A eluição seletiva de analitos ligados ionicamente pode ser obtida pela manipulação da carga do analito (quando ligado a trocadores de íons fortes) ou do sorvente (para analitos ligados a trocadores de íons fracos).