Guia para iniciantes em SPE
Uma ferramenta poderosa para melhorar o preparo de amostras
Como um cientista analítico, você se depara com muitos desafios ao determinar quais ferramentas podem ser utilizadas da melhor forma para atingir o resultado desejado. Determinar quais ferramentas e abordagens de preparo de amostras são considerações importantes que podem afetar significativamente seu sucesso.
O ideal é que você não precise fazer nenhum preparo de amostra. Porém, na realidade, o preparo de amostras é frequentemente necessário. Pode ser necessário otimizar um método para uma amostra existente para melhorar o rendimento ou reduzir o custo por análise. Ou pode ser solicitado que você analise uma grande variedade de tipos diferentes de amostras para relatar sobre novos compostos de interesse. Cada novo tipo de amostra pode apresentar diferentes desafios analíticos. Além disso, os cientistas hoje enfrentam o desafio significativo de relatar valores em níveis de concentração mais baixos do que nunca, sem comprometer a exatidão e a precisão.
Este livro foi elaborado para ajudar você a explorar e entender uma ferramenta muito poderosa na tecnologia de preparo de amostras: extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction). Você verá como essa tecnologia, que utiliza dispositivos com material de retenção cromatográfico, pode ajudar a atender aos seus desafios analíticos.
Definição de extração em fase sólida
SPE é uma tecnologia de preparo de amostras que utiliza partículas sólidas, material de retenção cromatográfico, geralmente contido em um dispositivo do tipo cartucho, para separar quimicamente os diferentes componentes de uma amostra. As amostras estão quase sempre no estado líquido (embora aplicações especiais possam ser executadas com algumas amostras na fase gasosa). A Figura 1 mostra uma amostra, que parece preta, sendo processada em um dispositivo de SPE, de forma que os compostos de corante individuais, que compõem a amostra, são separados cromatograficamente.
Figura 1. Exemplos de um método de SPE.
O leito cromatográfico pode ser utilizado para separar os diferentes compostos em uma amostra a fim de tornar os testes analíticos subsequentes mais bem-sucedidos. Por exemplo, a SPE é frequentemente utilizada para a remoção seletiva de interferências.
O nome tecnicamente correto para essa tecnologia é "Extração em fase líquida-sólida", uma vez que as partículas cromatográficas são sólidas, e a amostra está no estado líquido. Os mesmos princípios básicos de cromatografia líquida que são utilizados em HPLC também são aplicados aqui, mas em um formato diferente e por um motivo diferente. Aqui, a cromatografia é utilizada para preparar melhor uma amostra antes de ser enviada para testes analíticos.
No preparo de amostras, as amostras podem ser provenientes de uma ampla variedade de fontes. Elas podem ser fluidos biológicos, como plasma, saliva ou urina; amostras ambientais, como água, ar ou solo; produtos alimentícios, como grãos, carnes e frutos do mar; produtos farmacêuticos; nutracêuticos; bebidas; ou produtos industriais. Até mesmo cabeças de mosquitos podem ser a amostra! Quando um cientista precisava analisar neuropeptídeos extraídos do cérebro de mosquitos, a SPE era o método de preparo de amostras escolhido (Banco de dados de aplicações da Waters, 1983).
Os quatro principais benefícios da SPE
Há muitos benefícios em utilizar a SPE, mas quatro benefícios principais merecem atenção especial.
1. Simplificação da matriz de amostras complexas juntamente com a purificação do composto
Um dos problemas mais difíceis para um químico analítico é quando os compostos de interesse estão contidos em uma matriz de amostra complexa, como micotoxinas em grãos, resíduos de antibióticos em camarões ou metabólitos de medicamentos em plasma, soro ou urina. O grande número de constituintes ou substâncias interferentes na matriz da amostra, juntamente com os compostos de interesse, torna a análise extremamente difícil.
O primeiro problema a ser resolvido é a complexidade resultante da própria análise devido à presença de tantas entidades que devem ser separadas para identificar e quantificar o(s) composto(s) de interesse. Consulte a Figura 2.
Figura 2. Exemplo de uma amostra complexa.
A robustez do ensaio pode não ser adequada, pois qualquer pequena alteração pode afetar a resolução da separação de um importante par de analitos.
Outra consideração é que a presença de todas as interferências na matriz da amostra original pode resultar em tempo de inatividade do equipamento devido ao acúmulo de contaminação em cada injeção. Se as interferências fossem removidas como parte do preparo da amostra, os compostos de interesse poderiam ser analisados com um método mais simples e robusto. Isso pode ser visto na Figura 3, que compara a amostra original na parte superior com a nova amostra preparada por SPE na parte inferior.
Figura 3. Comparação de complexidades da matriz de amostras.
Um benefício adicional de simplificar a matriz de amostra é a exatidão de quantificação aprimorada. O traço azul superior para o composto 1 na Figura 4 inicialmente parece ser aceitável. No entanto, ele realmente tem alguma contaminação da matriz da amostra quando comparado com o traço da matriz da amostra em branco mostrado logo abaixo dele. Com um protocolo de SPE adequado, os traços inferiores mostram os mesmos compostos sem problemas com interferência, tornando a quantificação muito mais exata.
Figura 4. Quantificação aprimorada com melhor preparo de amostras.
Outro exemplo é mostrado na Figura 5. O traço superior mostra uma interferência significativa proveniente da matriz de amostra em ambos os compostos 1 e 2. O traço inferior mostra resultados muito melhores (linha de base limpa) devido ao preparo adequado da amostra com SPE. Observe que uma linha de base muito mais limpa melhora a exatidão dos resultados analíticos. Além disso, um extrato muito mais puro poderá ser obtido se a amostra exigir isolamento e purificação desse composto.
Figura 5. Melhoria significativa na linha de base utilizando a tecnologia SPE.
2. Redução na supressão de íons ou melhoria em aplicações de MS
O segundo problema com matrizes de amostras complexas pode ser visto quando analisamos a saída do espectrômetro de massas (LC-MS ou LC/MS/MS). Para uma resposta adequada do sinal de MS (sensibilidade), deve-se permitir que o íon do composto se forme adequadamente. Nos casos em que a formação do íon do composto é suprimida por interferências na matriz da amostra, a intensidade do sinal diminui muito.
Podemos ver esse efeito na Figura 6. A saída superior é o sinal para nossos compostos de interesse quando injetados em uma solução salina. O traço inferior mostra uma redução significativa na resposta (supressão > 90%) desses mesmos compostos quando foram analisados em plasma humano. Para o traço inferior, apenas uma etapa de precipitação de proteína comum foi realizada. Essa técnica não limpa as interferências da matriz que causam a supressão de íons, resultando em uma resposta de sinal insatisfatória.
Figura 6. Exemplo de supressão de íons devido à matriz de amostra.
Outro bom exemplo desse efeito de supressão pode ser visto na Figura 7. No traço superior da saída de MS, onde a amostra de plasma foi preparada com apenas uma etapa de precipitação de proteína, podemos ver que o pico de terfenadina é suprimido em 80%. No traço inferior, onde a mesma amostra foi preparada com um método de SPE, podemos ver uma supressão mínima de íons. Como as interferências da matriz da amostra foram removidas, isso permitiu que o íon do composto se formasse adequadamente, criando um sinal melhor.
Figura 7. Supressão de íons reduzida com SPE adequada.
Em alguns casos, as interferências da matriz da amostra podem aumentar artificialmente o sinal relatado para um composto. Isso é chamado de aprimoramento de íons, resultando em um valor relatado incorretamente alto. Um método de SPE adequado minimizará esse efeito limpando as interferências provenientes do composto, resultando em um valor relatado mais exato.
3. Capacidade de fracionar a matriz de amostra para analisar compostos por classe
Um analista pode se deparar com uma amostra que contém muitos compostos, com a necessidade de separá-los por classe para que outras análises possam ser realizadas com muito mais eficiência. Por exemplo, uma bebida refrigerante contém uma ampla variedade de compostos em sua formulação. Um método de SPE poderia ser desenvolvido para separar as diferentes classes de compostos, por exemplo, por sua polaridade. Os compostos polares podem ser coletados, como uma fração separada, a partir dos compostos mais apolares. Essas duas frações poderiam ser analisadas separadamente de uma forma muito mais eficiente porque seus compostos seriam mais semelhantes.
Um exemplo do poder de fracionamento por SPE é mostrado na Figura 8. Aqui, uma amostra complexa de um pó seco (mistura de bebida de uva roxa) é facilmente separada em quatro frações: uma fração apenas dos compostos polares, um composto vermelho purificado, um composto azul purificado e uma fração contendo todos os demais compostos muito apolares. Em outra parte deste livro, você verá como esse recurso pode ser muito eficiente.
Figura 8. Preparo de amostras por SPE.
Para uma discussão mais detalhada sobre a fração de amostra por SPE, consulte a página 125 na seção Desenvolvimento de métodos.
4. Concentração de traço (enriquecimento) de componentes de número muito baixos
Os analistas de hoje geralmente precisam relatar os compostos em níveis de concentração muito mais baixos do que nunca, em somente partes por trilhão (ppt) e ainda mais baixos. Normalmente, esses níveis são mais baixos na amostra pura do que a capacidade de sensibilidade dos equipamentos analíticos.
Um bom exemplo disso é a análise de traços de contaminantes em amostras ambientais ou o desenvolvimento de metabólitos ao longo do tempo em fluidos biológicos. O traço superior na Figura 9 mostra a resposta insatisfatória da amostra pura original para o composto de interesse. Utilizando as mesmas condições analíticas, mas com a amostra preparada com SPE utilizada em uma estratégia de concentração de traço, o traço inferior mostra um aumento significativo na força do sinal para este composto. Com esse resultado, um cálculo exato da concentração do composto original na amostra pura pode ser feito.
Figura 9. Exemplo de concentração de traço.
Sem a capacidade de retenção dos materiais de retenção cromatográficos em SPE, a capacidade de rastrear a concentração de um composto específico seria muito difícil, se não impossível, com outras abordagens de preparo de amostras.
Resumo
Como vimos, um dispositivo de SPE com um leito cromatográfico pode realizar quatro funções críticas para tornar a análise da amostra mais bem-sucedida. Consulte a Figura 10.
Figura 10. O poder da SPE.
Neste livro, nos esforçamos para fornecer todos os fundamentos e técnicas de sucesso de SPE originários de cientistas de todo o mundo que contaram com essa tecnologia nos últimos trinta anos. Atualmente, os cientistas estão descobrindo que a SPE é mais útil do que nunca na solução de problemas analíticos e de preparo de amostras difíceis.
Esperamos que este livro permita que você entenda e domine os recursos da SPE, para que também possa colocar o poder dessa tecnologia em utilização em seu laboratório.
