Guia para iniciantes em SPE

O que é extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction)?

Não se confunda com o termo extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction). Um dispositivo de SPE típico tem 50 vezes mais poder de separação do que uma extração líquido-líquido simples. A SPE é, na verdade, cromatografia líquido-sólido em coluna. Como a SPE é cromatografia líquida (LC, Liquid Chromatography), sua prática é regida pelos princípios de LC. Uma amostra é introduzida em uma coluna ou em um dispositivo de cartucho contendo um leito de partículas apropriadas, ou outra forma, de um material de retenção cromatográfico (fase estacionária). O solvente (fase móvel) flui através do leito. Ao escolher uma combinação adequada de fases móveis e estacionárias, os componentes da amostra podem passar diretamente pelo leito da coluna ou podem ser retidos seletivamente.

Cada composto na amostra parece tipicamente se deslocar em velocidades diferentes através do dispositivo. Utilizar um solvente mais fraco faz com que eles se movam lentamente e/ou fiquem fortemente retidos. Um solvente mais forte acelera sua passagem pelo leito e elui o(s) analito(s) em um volume mais concentrado. A eluição de um dispositivo de SPE geralmente é feita aumentando a força da fase móvel em uma série de etapas separadas, em vez de contínuas, durante as quais os analitos selecionados ou as interferências são totalmente retidas ou eluídas rapidamente — essa variação de eluição do gradiente é chamada de gradiente em etapas.

A prática mais comum da SPE é feita utilizando dispositivos de cartucho ou coluna em miniatura. Um exemplo é mostrado aqui. Uma mistura de três corantes é carregada no cartucho em um solvente fraco, causando forte retenção de amostra em uma faixa estreita que aparece preta na entrada da coluna. Etapas de gradiente subsequentes, cada uma com um solvente sucessivamente mais forte, são utilizadas para eluir os corantes individualmente (amarelo, vermelho e azul).

Os cartuchos de SPE típicos são dispositivos de baixa pressão, fabricados em vidro ou plástico resistente a solventes, preenchidos com partículas ≥ 30 µm de diâmetro. As taxas de fluxo adequadas podem ser obtidas por gravidade ou com a ajuda de vácuo ou baixa pressão positiva. (Este último requer colocar uma tampa na entrada aberta de uma coluna ou utilizar um dispositivo vedado com conexões de entrada e saída.)

Importância do preparo de amostras

Nas últimas duas décadas, os avanços significativos nos sistemas de gerenciamento de informações de laboratório e nos equipamentos analíticos mudaram as tarefas predominantes do analista, das medições de ensaio para o preparo de amostras e processamento de dados. Como houve um aumento no rigor dos requisitos para maior sensibilidade, seletividade, exatidão, precisão e número de amostras a serem processadas, os aumentos correspondentes na velocidade e sofisticação da análise e coleta de dados ultrapassaram as melhorias nas muitas técnicas tradicionais de coleta e preparo de amostras. Segundo algumas estimativas, 75 a 80% da atividade de trabalho e do custo operacional em um laboratório analítico contemporâneo são gastos no processamento e preparo de amostras para introdução ou injeção em um dispositivo de medição e/ou separação analítica. Claramente, os esforços direcionados e os produtos projetados para agilizar os protocolos de preparo de amostras são essenciais para o progresso futuro na ciência analítica.

Objetivos do preparo de amostras

O preparo correto de amostras para a maioria das técnicas analíticas (HPLC, GC, espectrofotometria, RIA, etc.) tem um objetivo triplo: ou seja, fornecer o componente da amostra de interesse

• em solução
• livre de interferência de elementos da matriz
• a uma concentração apropriada para detecção ou medição

Para atingir esses objetivos, uma amostra, ou uma porção representativa da mesma (nem sempre fácil de obter), é preparada por meio de métodos tradicionais de dissolução, homogeneização, extração (fase líquida ou sólida), filtração, concentração, evaporação, separação, derivatização química, padronização (interna ou externa), etc.

Normalmente, esses métodos são utilizados em combinações de várias etapas, que formam um protocolo de preparo de amostras. Quanto menos etapas e métodos forem utilizados em qualquer protocolo, mais simples, mais conveniente, mais econômico e menos demorado ele será. Protocolos mais simples se prestam mais prontamente à automação e também levam a maior exatidão, confiabilidade, reprodutibilidade e segurança.

Inovação em métodos de preparo de amostras

Há muitas maneiras de combinar ferramentas e técnicas padrão para atingir os objetivos do preparo de amostras. No entanto, é melhor buscar meios inovadores para agilizar os protocolos de preparo de amostras:

• combinar as funções de várias etapas, se possível, em uma operação;
• eliminar transferências e manipulações desnecessárias de amostras;
• reduzir a escala tanto quanto possível (ganhando economia de tempo, trabalho e custo);
• utilizar novas ferramentas de forma criativa.

Benefícios dos cartuchos de extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction)

Quando comparada a outros processos de preparo de amostras, a extração em fase sólida com cartuchos de SPE oferece:

Obtenção dos objetivos de preparo de amostras com extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction)

• Para remover os constituintes da amostra que eluem após os analitos de interesse ou são fortemente adsorvidos:
  • Utilize extração em fase sólida com recheio de superfície do sorvente que seja a mesma da coluna de HPLC analítica.
  • Adapte as etapas de gradiente para eluir os analitos seletivamente.
• Para remover os constituintes da amostra que coeluem com um analito de interesse:
  • Utilize extração em fase sólida com recheio de superfície do sorvente e/ou modo de separação diferente daquele na coluna analítica.
  • Adapte as etapas de gradiente para eluir os analitos seletivamente.
• Para enriquecer os componentes da amostra presentes em baixa concentração:
  • Adapte as etapas de gradiente para eluir os analitos seletivamente.
  • Utilize volumes de amostra "grandes" em solvente de promoção de adsorção.
  • Utilize um volume de coleta "pequeno" em solvente que promova a dessorção.
  • Utilize o recheio do sorvente personalizado para o analito, independentemente daquele presente na coluna analítica.
  • Escolha cuidadosamente o recheio da coluna de extração em fase sólida, de forma que o preparo de amostras adicional seja desnecessário.
• Para dessalinizar amostras:
  • Primeiro, adsorva os analitos no sorvente de fase reversa enquanto o sal é rompido sem retenção.
  • Em seguida, depois de utilizar água para remover o sal residual, dessorva os analitos com solvente orgânico miscível em água.
• Para trocar solventes:
  • Adsorva a amostra completamente em um sorvente fortemente retentivo e enxágue o solvente original com um eluente mais fraco.
  • Elua o analito com o solvente desejado.
• Para fracionar classes de compostos:
  • Utilize uma sequência de gradiente em etapas para dividir uma amostra, com base na hidrofobicidade, polaridade ou carga, em frações contendo grupos de analitos que compartilham propriedades em comum.
• Para derivatizar analitos utilizando reagentes de fase sólida:
  • Adsorva um reagente de derivatização na superfície do sorvente; em seguida, colete a amostra (geralmente um gás) sob condições que favoreçam a adsorção completa do analito; aguarde até que a reação ocorra e, em seguida, elua seletivamente a derivada.