Spectrométrie de masse – Guide technique

Lorsqu’un composé est déjà connu, comme dans le cas d’essais cliniques où des données statistiques sont recueillies à partir de nombreux échantillons individuels et où le médicament administré et son métabolite d’intérêt sont déjà bien caractérisés, il n’est pas nécessaire d’obtenir des spectres de masse complets. En revanche, on souhaite obtenir une très bonne sensibilité dans un mélange physiologique complexe. L’instrument est donc configuré pour ne surveiller que des valeurs m/z spécifiques. Référez-vous à la comparaison des réponses SIR et MRM illustrée dans une précédente section de ce guide technique.

Comme les ions traversent en continu le quadripôle triple ou en tandem, il n’est pas nécessaire de limiter le courant ionique dans l’analyseur de masse. Le piège à ions, quant à lui, a un volume limité et défini. Il faut donc restreindre la quantité d’ions pénétrant dans le piège. Sans contrôle de l’intensité ionique, le spectre affichera des pics indésirables ou inattendus, ce qui est particulièrement problématique lorsque l’on souhaite rechercher en bibliothèque des spectres EI acquis par GC/MS. La conception des pièges à ions a considérablement évolué et permet aujourd’hui de recourir à une ionisation externe, où les ions sont générés à l’extérieur du filtre de masse puis injectés dans le piège, plutôt qu’à une ionisation interne, où les ions sont générés dans le filtre de masse. Cette évolution a résolu le problème des réactions ion-molécule intervenant dans le piège, mais a également introduit une nouvelle limite. Même en mode MRM, cette régulation automatique du courant ionique total peut entraîner des intervalles d’échantillonnage irréguliers sur un pic chromatographique. Cela se traduit par une limitation des capacités du piège à ions lorsqu’il s’agit d’analyser des composés à l’état de traces dans des matrices complexes. Cela est particulièrement vrai pour les analyses nécessitant une exactitude et une fidélité optimales, par exemple lorsque les résultats doivent être juridiquement défendables ou lorsque la quantification doit répondre à des critères stricts d’exactitude et de fidélité en vertu de la législation.

On utilise généralement un étalon interne pour réaliser une quantification par MS. L’étalon permet de contrôler la variabilité des processus d’extraction, d’injection LC et d’ionisation. Sans étalon interne, l’écart-type relatif observé entre les réplicats peut être dix fois plus élevé qu’avec des réplicats référencés par rapport à un étalon, qui produit généralement un écart-type relatif est inférieur à 10. Le meilleur étalon interne est une version de la molécule d’intérêt marquée par isotope. Bien que la synthèse d’une telle molécule s’avère coûteuse, elle permettra d’obtenir un rendement d’extraction, un temps de rétention chromatographique et une réponse d’ionisation similaires dans le spectromètre de masse.

L’évaluation de l’aptitude du système, la randomisation des échantillons et la détermination des courbes et des points de concentration appropriés font l’objet de longs débats. Vous trouverez de bonnes références à ce sujet à l’adresse https://www.ionsource.com/tutorial/msquan/requantoc.htm.

Étalonnage

Les analystes ont recours à des composés étalons pour ajuster l’échelle d’étalonnage des masses, ainsi que l’intensité relative des ions, afin de les faire correspondre aux entités connues. Cette opération est effectuée sur tous les spectromètres de masse, car de légères variations de facteurs comme le système électronique, la propreté des surfaces et les conditions ambiantes du laboratoire peuvent affecter la capacité de l’instrument à reproduire une mesure significative. Pour les analyses les moins exigeantes réalisées à l’aide d’instruments à masse nominale, on pourra réaliser l’étalonnage de façon plus occasionnelle et vérifier sa réponse plus fréquemment. Néanmoins, une exactitude en masse élevée nécessitera une surveillance constante des variations les plus infimes.

Pour la GC/MS, on utilise fréquemment le composé FC-43, également appelé perfluorotributylamine, à des fins d’étalonnage. D’autres mélanges de composés d’étalonnage permettent d’ajuster l’échelle d’étalonnage d’un spectromètre de masse haute résolution. Les mélanges d’iodure de sodium et de césium (NaCsI) et de polyéthylène glycol sont couramment utilisés pour la LC/MS. Dans un solvant compatible avec la LC/MS, l’injection ou l’infusion de NaCsI à l’état stable sur un instrument génère une série de pics monoisotopiques atteignant 4 000 Da.

Des kits contenant une sélection de peptides, de protéines, de matrices et de solvants étalons sont disponibles pour l’étalonnage, le réglage et les tests de sensibilité des spectromètres de masse à désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI). L’un d’entre eux, commercialisé par Sigma Aldrich, permet de configurer un instrument pour l’analyse de mélanges complexes de protéines et de peptides (de 700 à 66 000 Da).

Masse de référence LockMass

Une vigilance constante doit être accordée aux mesures les plus exigeantes réalisées sur des spectromètres à temps de vol et d’autres instruments similaires offrant une exactitude élevée. Une légère variation de température peut à elle seule décaler les résultats de masse rapportés de plusieurs parties par million. Selon le type d’ionisation utilisé, il est possible de corriger constamment l’étalonnage en utilisant simplement un contaminant connu présent dans la source. Vous pouvez également échantillonner régulièrement un flux ionique pour rétablir un étalonnage correct tout au long d’une analyse. Le simple ajout d’un étalon de masse de référence Lockmass au débit d’éluant LC, par le biais d’une dérivation en aval de la colonne et en amont de l’entrée du spectromètre de masse, provoque souvent des comportements incontrôlés tels qu’une suppression ionique, des interférences de masse et des effets imputables aux solvants.

Les instruments à temps de vol (ToF), décrits précédemment dans ce guide technique, peuvent atteindre une exactitude de quelques parties par million, tandis que les instruments à résonance cyclotron ionique à transformée de Fourier (FTICR) sont capables d’une exactitude encore plus élevée, à condition que le nombre d’ions admis soit bien contrôlé. Le réétalonnage en temps réel de la masse de référence, en corrigeant tout décalage de la masse, permet d’éliminer l’erreur de masse par rapport à celle établie lors de l’étalonnage de l’échelle des masses. La faiblesse du signal est une autre cause souvent négligée. Elle peut être corrigée en calculant la moyenne de la mesure de masse sur le pic chromatographique, pondérée par l’intensité du signal.

Une source à double électrospray optimisée pour l’acquisition de données en masse exacte est idéale pour les études de protéomique ou l’identification de métabolites à faible concentration. La méthode utilisant deux sondes ESI indépendantes échantillonne le flux du spray de correction (ou de référence), en utilisant un déflecteur oscillant entraîné par un moteur pas-à-pas programmable. Le spray de référence est échantillonné à intervalles prédéfinis, garantissant que le cycle d’acquisition favorise le débit de liquide contenant l’analyte. La position du déflecteur d’échantillonnage est suivie en temps réel, ce qui permet d’indexer les deux entrées de liquide. Les données de référence et d’échantillon sont stockées dans des fichiers séparés. Cette configuration élimine les interférences entre les canaux de l’analyte et de référence.