Guide technique de la chromatographie en phase liquide préparative

1. Antioxidant Isolation Using the Prep 150 LC System (Isolement d'antioxydants à l'aide du système Prep 150 LC).
2. Peptide Isolation Using the Prep 150 LC System (Isolement de peptides à l'aide du système Prep 150 LC).
3. Purification of Cannabinoid from Hemp Oil Using the Prep 150 LC System (Purification de cannabinoïdes à partir d'huile de chanvre à l'aide du système Prep 150 LC).
4. Isolation of Flavonoids from Ginko Biloba Leaf Using the Waters Prep 150 LC System (Isolement de flavonoïdes à partir de feuilles de ginkgo biloba à l'aide du système Prep 150 LC de Waters).
5. Isolation of a Natural Product from Echinacea Extract Using the Prep 150 LC (Isolement d'un produit naturel à partir d'un extrait d'échinacée à l'aide du système Prep 150 LC).
6. Streamlining Compound Isolation Automatically with UPLC to Prep Chromatography Using Mass-Directed AutoPurification (Transposition automatique de l'isolement des composés avec l'UPLC vers la chromatographie préparative à l'aide d'un système Autopurification avec détection de masse).
7. Mass-Directed Isolation of a Synthetic Peptide Using the ACQUITY QDa Detector (Isolement assisté par la détection de masse d'un peptide synthétique à l'aide du détecteur ACQUITY QDa).
8. Strategies for Improving Isolation Using Large Volume Leading and Easy Method Development in Prep Chromatography (Stratégies pour l'amélioration de l'isolement à l'aide d'un chargement de volume important et d'un développement facile de méthodes en chromatographie préparative).
9. Techniques for Improving the Efficiency of Large Volume Loading in Prep Liquid Chromatography (Techniques d'amélioration de l'efficacité du chargement de volume important en chromatographie en phase liquide préparative).
10. Mass-Directed Isolation of Sulfa Compounds from an Antibiotic Mixture with an ACQUITY QDa Detector (Purification d'un composé de sulfamide à partir d'un mélange antibiotique à l'aide du détecteur de masse ACQUITY QDa).
11. Mass Directed Isolation pf a Pharmaceutical Compound Using AutoPurify with an ACQUITY QDa Detector (Purification d'un composé pharmaceutique à l'aide d'AutoPurify avec un détecteur de masse ACQUITY QDa).
12. Typical Conditions for Analyzing and Isolating the Compounds in the Prep Chromatography Mixture Standard with an ACQUITY QDa Detector (Conditions générales pour analyser et purifier les composés d'un mélange étalon pour chromatographie préparative à l'aide du détecteur de masse ACQUITY QDa).
13. Preparatory Chromatography of Natural Product Extracts Utilizing a UV-Based Open Access Walk-up Purification Strategy (Chromatographie préparatoire d'extraits de produits naturels à l'aide d'une stratégie de purification Walk-up par UV en libre accès).
14. A modular Prep HPLC System for the Isolation of Puerarin from Kudzu Root Extracts (Un système Prep HPLC modulaire pour l'isolement de puérarine à partir d'extraits de racine de kudzu).
15. Improving Resolution and Column Loading Systematically in Prep Liquid Chromatography for Isolating a Minor Component from Peppermint Extract (Amélioration systématique de la résolution et de la capacité de charge des colonnes en chromatographie en phase liquide préparative pour la purification d'un composé minoritaire d'un extrait de menthe poivrée).
16. Small Scale Peptide and Impurity Isolation Using the ACQUITY UPLC H-Class and Waters Fraction Manager-Analytical Systems (Isolement de peptides et d'impuretés à petite échelle à l'aide du système ACQUITY UPLC H-Class et du gestionnaire de fractions analytique de Waters).
17. Small Scale Purification of Constituents from Complex Natural Product Extracts Using ACQUITY H-Class and Waters Fraction Manager- Analytical Systems (Purification à petite échelle des constituants d'extraits d'un produit naturel complexe à l'aide du système ACQUITY H-Class et du gestionnaire de fractions analytique de Waters).
18. Technique « at-column dilution », notes d'application, révision A, Waters Corp, 2003. Pour plus d'informations sur les notes d'application et les références utiles, rendez-vous sur www.waters.com et saisissez les numéros de référence bleus ci-dessus dans le champ de recherche. 

CONCLUSION :

• Technique « at-column dilution » : technique d'injection brevetée qui augmente la capacité de charge, améliore la résolution, augmente la durée de vie de la colonne et améliore la robustesse du système LC en diluant l'échantillon dans un solvant fort en tête de colonne. Chromatogramme : présentation graphique ou autre de la réponse d'un détecteur ou d'une autre quantité utilisée comme mesure de la concentration de l'analyte dans l'effluent en fonction du volume d'effluent ou du temps. Volume de la colonne (V_c), V_c = π x (r)² x hauteur x 66 %, disponible pour la phase mobile/1 000 pour convertir les mm³ en mL : volume géométrique de la partie du tube qui contient le remplissage (surface transversale interne du tube multipliée par la longueur du lit, en L, avec une compensation pour l'espace occupé par le matériau de remplissage, soit 66 %) sur une petite partie du débit vers le détecteur, tandis que la partie principale va au collecteur de fractions. Le volume mort existe toujours, mais comme la concentration en phase mobile est constante, aucune différence n'est observée entre les chromatogrammes analysés sur des systèmes à volume mort différents. Éluat, éluant, élut : l'éluat désigne la partie de l'éluant qui sort ou qui élue de la sortie de la colonne contenant les analytes en solution. En HPLC analytique, l'éluat est examiné par le détecteur pour déterminer la concentration ou la masse des analytes. En HPLC préparative, l'éluat est recueilli en continu sous forme d'aliquotes à intervalles de temps ou de volume uniformes, ou de façon discontinue uniquement lorsqu'un détecteur indique la présence d'un pic d'intérêt. Ces fractions sont ensuite traitées pour obtenir des composés purifiés. Hydrophobe : qualité que possèdent les radicaux ou les molécules non polaires plus solubles dans les solvants organiques que dans l'eau. Chromatographie par échange d'ions : la chromatographie par échange d'ions, ou chromatographie ionique, est un procédé chromatographique qui sépare les ions des molécules polaires en fonction de leur affinité pour l'échangeur d'ions. La technique de séparation est utilisée pour tout type de molécule chargée, comme les grandes protéines, les petits nucléotides et les acides aminés. Isocratique : la composition de la phase mobile reste constante au cours d'une séparation chromatographique. Solvant d'appoint : solvant utilisé pour diluer et transférer les fractions d'échantillon depuis le flux de préparation vers les détecteurs dans un système de purification assistée par la détection de masse. Phase mobile : solvants utilisés pour éluer les composés d'une colonne HPLC. Débit : volume de la phase mobile qui traverse la colonne, exprimé en unité de temps. Injecteur (passeur d'échantillons, module d'injection : mécanisme permettant d'introduire (injecter) avec exactitude et fidélité un volume prédéfini d'une solution d'échantillon dans le flux de phase mobile. Élution isocratique : la composition de la phase mobile reste constante pendant le processus d'élution. Phase mobile : fluide qui se déplace, dans une direction définie, sur toute la longueur du lit de sorbant de la phase stationnaire. Pic : enregistrement de la réponse du détecteur alors qu'un seul composant est élué à partir de la colonne. Résolution : séparation de deux pics, exprimée comme la différence entre leurs temps de rétention correspondants, divisée par leur largeur de pic moyenne au niveau de la ligne de base. R_s = 1,25 indique que deux pics de largeur égale sont juste séparés au niveau de la ligne de base. Lorsque R_s = 0,6, la seule indication visuelle de la présence de deux pics sur un chromatogramme est une petite encoche à proximité du sommet du pic. Temps de rétention (RT) : temps qui s'écoule entre le début de l'injection ou l'introduction de l'échantillon et l'apparition du maximum du pic. Sélectivité : terme utilisé pour décrire la grandeur de la différence entre les affinités relatives d'une paire d'analytes pour les phases mobile et stationnaire spécifiées qui constituent le système de séparation. Échelle (Mise à l'échelle) : la quantité d'isolat purifié souhaitée par isolement détermine l'échelle et dicte le diamètre de la colonne et les exigences relatives au système et au matériel. Les quantités peuvent aller de l'isolement ou de la purification de petites quantités d'enzymes en µg à de grandes quantités en kg nécessaires à la fabrication industrielle de médicaments. La mise à l'échelle est la génération de quantités accrues d'un composé particulier en vue d'une évaluation approfondie après une démonstration initiale de sa valeur potentielle. Gradient en escalier : méthode de séparation qui maintient la pente avant et après une partie ciblée à faible pente du gradient, préservant ainsi le profil chromatographique de ces parties de la séparation ; souvent utilisée pour déterminer le volume mort du système. Silanol : groupe chimique lié au matériau de remplissage de la colonne à support en silice disponible pour interagir avec l'échantillon. Diviseur : utilisé pour dériver une petite partie du flux d'échantillon vers un détecteur destructeur, par exemple pour la purification par spectrométrie de masse. Phase stationnaire : solide poreux (par exemple, du verre, de la silice ou de l'alumine) qui est tassé dans un tube en verre ou en métal, ou qui constitue les parois d'un capillaire à tube ouvert ; la phase mobile s'écoule à travers le lit ou la colonne, l'échantillon à séparer est injecté au début de la colonne et est transporté à travers le système par la phase mobile ; des substances différentes se répartissent suivant leur affinité relative pour les deux phases. Vitesse d'analyse : avantage de réaliser des séparations LC à des vélocités linéaires plus élevées en utilisant des colonnes analytiques de faible volume et de faible granulométrie, ou des colonnes préparatives de granulométrie et de volume importants ; une résolution, une vitesse et une efficacité plus élevées permettent généralement une vitesse d'analyse plus élevée ; de plus grandes quantités de composé peuvent être purifiées par analyse ou par période de traitement.

GLOSSAIRE

1. Volume du système : volume mort, volume de délai, volume du système depuis le point de mélange des solvants de la phase mobile jusqu'à leur arrivée en tête de la colonne ; pour les systèmes LC à mélange haute pression, le mélangeur, la tubulure de raccordement et la boucle du passeur d'échantillons en sont les principaux composants, ce qui n'a d'importance pratique que pour les applications à gradient.
2. Rapport de division : quantité de matériau continuellement « retirée » et diluée du flux d'échantillon avant son transfert vers les détecteurs pendant la purification assistée par la détection de masse.
3. Chromatographie d'exclusion stérique : séparation chromatographique des composés en fonction de leur taille en solution.
4. Gradient à pente douce : gradient dans lequel la vitesse de variation de la concentration en solvant organique par volume de colonne est faible ; utilisé pour séparer les composés ayant une affinité similaire pour la matrice de la colonne.
5. Gradient segmenté : méthode de séparation qui inclut plusieurs gradients avec des pentes différentes pour séparer plusieurs composés ayant une sélectivité différente. et la plus haute vitesse d'analyse.
6. Sensibilité (S) : signal émis par unité de concentration ou unité de masse d'une substance dans la phase mobile entrant dans le détecteur. Pour les détecteurs sensibles au débit massique, il s'agit du rapport de la hauteur du pic à l'unité de masse.
7. Chromatographie en phase inverse : procédure d'élution utilisée en chromatographie en phase liquide, dans laquelle la phase mobile est significativement plus polaire que la phase stationnaire.
8. Facteur de rétention (k) : mesure du temps durant lequel le composé de l'échantillon reste dans la phase stationnaire par rapport au temps qu'il passe dans la phase mobile ; elle exprime le délai durant lequel un composé de l'échantillon est retenu par la phase stationnaire par rapport au temps qu'il lui faudrait pour traverser la colonne à la vitesse de la phase mobile.
9. Chromatographie préparative : procédé consistant à utiliser la chromatographie en phase liquide pour isoler un composé en une quantité et à un niveau de pureté suffisants pour permettre des expériences ou utilisations ultérieures.
10. Diviseur passif : appareil utilisé pour échantillonner en continu le débit principal ou le débit de préparation avec un rapport de division défini ; gère le signal du détecteur dans le cadre d'une purification assistée par la détection de masse.
11. Chromatographie en phase liquide (LC) : technique de séparation dans laquelle la phase mobile est un liquide.
12. Orifice d'entrée : extrémité du lit de colonne où entrent le flux de phase mobile et l'échantillon.
13. Gradient : variation dans le temps des concentrations relatives de deux composés de solvants miscibles (ou plus), qui forment une phase mobile de force d'élution croissante.
14. Facteur modificateur de phase mobile : additifs mélangés aux solvants chromatographiques pour améliorer la séparation.
15. Capacité de charge : également appelée « charge massique » ; quantité maximale de matériau pouvant être injectée sur une colonne, la résolution du composé d'intérêt étant correctement maintenue.
16. Gradient linéaire : méthode de séparation chromatographique qui modifie la composition de la phase mobile à un rythme constant sur une période donnée.
17. Ionisation : procédé par lequel une molécule acquiert une charge négative ou positive en gagnant ou en perdant des électrons pour former des ions.
18. Hydrophile : se dissout ou interagit facilement avec l'eau ou les solvants polaires en raison de la présence de groupes fortement polaires.
19. Équilibrage : pour les méthodes chromatographiques utilisant un gradient, un temps d'équilibrage postérieur à l'analyse est nécessaire pour que la colonne et le système reviennent aux conditions initiales de la phase mobile avant l'injection suivante. Pour obtenir un équilibrage adéquat, la colonne doit être rincée avec 5 fois son volume total de colonne (VC), plus 3 fois le volume du système (temporisation) dans les conditions de démarrage de la méthode. Gradient Chromatographie Colonne Rééquilibrage, Performance Perspectives, Waters Corp. 1998. Pente du gradient : vitesse de variation de la composition de solvant organique par volume de colonne pendant une séparation par gradient.
20. Efficacité : mesure de la capacité d'une colonne à résister à la dispersion d'une bande d'échantillon lors de son passage à travers le lit conditionné. Une colonne efficace minimise la dispersion ou l’étalement des bandes. Une efficacité plus élevée est importante pour une séparation efficace, une plus grande sensibilité et/ou une identification des composés similaires dans un mélange d'échantillons complexe.
21. Volume mort : volume du système depuis le point de mélange des solvants de la phase mobile jusqu'à leur arrivée en tête de la colonne ; pour les systèmes LC à mélange haute pression, le mélangeur, la tubulure de raccordement et la boucle du passeur d'échantillons constituent les principaux composants, lorsque les composants de la phase mobile sont mélangés en ligne dans un contexte isocratique.
22. Détecteur : appareil qui indique un changement de composition de l'éluant en mesurant les propriétés physiques ou chimiques (par exemple, l'absorbance de la lumière UV/visible, l'indice de réfraction différentiel, la fluorescence ou la conductivité). Certains détecteurs (par exemple, les détecteurs électrochimiques ou les spectromètres de masse) sont destructeurs, c'est-à-dire qu'ils modifient chimiquement les composés de l'échantillon. Si un détecteur est destructeur pour l'échantillon, il faudra ajouter un diviseur de flux pour dériver ce dernier.
23. Chromatographie : méthode de séparation dans laquelle les composés à séparer sont répartis entre deux phases, dont l'une est stationnaire (la phase stationnaire) tandis que l'autre (la phase mobile) se déplace par rapport à la phase stationnaire.
24. Chromophore : partie d'une molécule qui absorbe certaines longueurs d'onde de la lumière visible et en transmet ou réfléchit d'autres. Le chromophore est une région de la molécule où la différence d'énergie entre deux orbitales moléculaires différentes se situe dans la plage du spectre visible. La lumière visible qui frappe le chromophore peut ainsi être absorbée en excitant un électron de son état fondamental à un état excité.

RÉFÉRENCES

• La chromatographie préparative est devenue une technique inestimable pour la fabrication de produits pharmaceutiques, l'isolement de produits naturels et d'autres opérations importantes nécessitant la génération d'un matériau purifié. Une utilisation optimale de la technique est directement proportionnelle à la qualité du développement de la méthode. Une fois qu'un système de purification a été équipé du matériel et des logiciels appropriés pour une purification à grande échelle, le transfert de méthode d'une méthode à petite échelle à une méthode à grande échelle devient une question de routine. .
  • Sarker, S., Latif, Z., Gray, A., “Natural Products Isolation” Second Edition. Humana Press. 2006.
  • Aubin, A. "UV-Directed Purification of a Small-Scale Organic Synthesis," Waters Corporation, Milford, MA USA. 2008.
  • Diehl, D. Fountain, K. Wheat, T. Joblonski, J. Yin, Z. Morrison, D; Collier, S. Murphy, B. Cleary, R. Compagnon, L., "Practical Chemistry Considerations for Purification." Waters Presentation. 2008.
  • Dolan, J. “A Guide to HPLC and LC-MS Buffer Selection.” Advanced Chromatography Technologies. www.ace-HPLC.com.
  • Jablonski, J et.al. “Effective Use of Temperature Control in Compound Isolation.” Waters Corporation, Milford, MA USA.
  • "At-Column-Dilution, Application Notes", Waters Corp, 2003.
  • Pour plus d'informations sur les notes d'application et les références utiles, rendez-vous sur www.waters.com et saisissez les numéros de référence en bleu ci-dessus dans le champ de recherche.