Guide technique de la chromatographie en phase liquide préparative

Lors de la démonstration initiale de la valeur potentielle d'un isolat, une méthode de séparation peut être « mise à l'échelle » pour générer des quantités croissantes de cet isolat en vue d'une évaluation approfondie. Les attributs de séparation à petite échelle, comme la résolution, peuvent facilement être maintenus à grande échelle. Le débit, la charge d'échantillon et la géométrie des colonnes du système doivent être modifiés pour transférer efficacement la séparation vers des colonnes de capacité supérieure par le biais de formules mathématiques définies.

La première étape de la mise à l'échelle englobe généralement la production d'isolat en quantités allant du mg au gramme pour diverses utilisations, de l'évaluation biologique précoce à l'établissement de relations structure-activité pour des analogues de produits dotés de propriétés thérapeutiques améliorées. Les étapes ultérieures de la mise à l'échelle impliquent des quantités de matériau allant de 100 g à plusieurs kilogrammes, voire au-delà, pour le développement préclinique et clinique qui, en cas de succès, déboucheront sur une fabrication à grande échelle. À cette échelle, la documentation et les contrôles qualité tels que les bonnes pratiques de fabrication (cGMP) entrent en jeu.

La procédure de mise à l'échelle est un processus par étapes. Les calculs de mise à l'échelle doivent être effectués avec précision, faute de quoi le résultat final peut ne pas fournir la résolution obtenue dans la séparation à petite échelle. Pour favoriser la réussite de la mise à l'échelle de la méthode et conserver le temps de rétention et la sélectivité, plusieurs conditions sont requises et doivent être bien prises en compte :

• Une phase mobile identique doit être utilisée à petite et à grande échelle.
• Des colonnes de chimie de colonne, de longueur et de granulométrie identiques facilitent la mise à l'échelle. (Vous pouvez également modifier la granulométrie tant que le rapport L/dp de la longueur de colonne sur la granulométrie de la méthode initiale est conservé).
• Les échantillons doivent être préparés à la même concentration dans le même diluant.

Détermination du volume mort

Le volume mort (volume de délai, volume du système) est important pour préserver la résolution des pics à élution précoce lors d'une mise à l'échelle ou d'un changement de système. Il est défini comme le volume entre le point de formation du gradient et la tête de la colonne. Pour les systèmes LC à mélange haute pression, ce volume comprend principalement le mélangeur, les tubulures de connexion et la boucle du passeur d'échantillons. Les systèmes à mélange basse pression combinent les solvants en amont de la pompe. Une tubulure supplémentaire, le volume de la ou des têtes de pompe,le mélangeur, les tubulures de raccordement et la boucle du passeur d'échantillons contribuent donc au volume mort global.

Lorsque les composés de la phase mobile sont mélangés en ligne pour des séparations isocratiques, le volume mort existe toujours, mais comme la concentration en phase mobile est constante, aucune différence chromatographique n'est observable. Les méthodes par gradient, quant à elles, reposent sur une variation de la concentration de la phase mobile dans le temps pour générer la séparation des pics. La compensation du volume mort dans une méthode à gradient garantit la conservation des temps de rétention des pics, ce qui est particulièrement important lorsque l'objectif est de collecter des fractions purifiées.

Pour déterminer le volume mort, un gradient en escalier de phase mobile A et les solvants de phase mobile B contenant un additif ayant une absorption UV différente (par exemple 0,05 mg/mL d'uracil ou 0,2 % d'acétone dans de l'acétonitrile) peuvent être utilisés selon la méthode disponible à l'adresse suivante : www.waters.com/prepcalculator dans la rubrique « Analytical to Prep Gradient Calculator » (Calculateur de gradient analytique à préparatif).

Capacité

En chromatographie de purification, l'objectif principal est de maintenir une résolution adéquate pour le composé destiné à être recueilli. La capacité de la colonne, ou charge, est mesurée par la résolution du composé et des pics voisins. Bien que la capacité de la colonne soit principalement influencée par la longueur et le diamètre de la colonne, d'autres facteurs, tels que la solubilité et la complexité du mélange d'échantillons, peuvent y contribuer. Les tendances de la capacité sont les suivantes :

• La capacité dépend principalement de la solubilité de l'échantillon en question.
• La capacité est plus importante pour les mélanges simples.
• La capacité est plus faible lorsqu'une résolution élevée est requise.
• La capacité dépend des conditions de chargement.

La capacité pour un composé d'intérêt spécifique est déterminée avant la mise à l'échelle de la méthode par le biais d'études de charge. Ces études sont réalisées à petite échelle par l'une des techniques suivantes : un échantillon est préparé à une concentration élevée et le volume d'injection est progressivement augmenté, ou un échantillon est préparé à plusieurs concentrations et le volume d'injection est maintenu constant. Quelle que soit la technique, l'objectif est de déterminer la concentration maximale ou le volume d'injection qui maintient une résolution adéquate du composé d'intérêt par rapport aux impuretés environnantes. Une fois la capacité de la colonne déterminée, elle peut être mise à l'échelle à l'aide d'une formule pour les colonnes de plus grand diamètre et les procédures plus importantes.

Équation 10 : Mise à l'échelle de la charge de concentration

Par conséquent, pour mettre à l'échelle une charge de 1 800 µg (1,8 mg) sur une colonne analytique de 4,6 mm x 50 mm à la charge équivalente sur une colonne préparative de 19 mm x 50 mm :

Équation 11 : Mise à l'échelle du volume d'injection

Pour augmenter la charge de volume d'une injection de 20 µL :

Technique « at-column dilution »

Les solvants forts tels que le DMSO peuvent améliorer la solubilité des échantillons, entraînant une augmentation potentielle de la capacité de la colonne. Malheureusement, de grands volumes d'injection de solvants forts peuvent distordre la chromatographie, entraînant une réduction plutôt qu'une augmentation de la quantité de produit pouvant être isolée avec succès.

Une distorsion se produit lorsqu'un solvant fort est transporté de l'injecteur vers la tête de colonne sous forme d'un bouchon pris en sandwich dans un courant de solvant aqueux. Une précipitation de l'échantillon peut se produire sur les bords du bouchon, là où le solvant fort de l'échantillon est dilué avec le solvant aqueux. Cette précipitation peut obstruer le circuit fluidique et provoquer l'arrêt du système haute pression.

Si la précipitation ne provoque pas l'arrêt du système, l'échantillon entre dans la colonne, mais il n'y a pas de rétention tant que le bouchon d'échantillon n'est pas dilué avec la phase mobile. Avec des injections plus importantes, le volume nécessaire à la dilution de l'échantillon ne peut être dévié qu'en déplaçant le bouchon sur une distance importante le long de la colonne. Dans ce cas, l'échantillon se dépose sous forme d'une large bande qui occupe une grande partie du volume de la colonne. Il en résulte une résolution incomplète des pics étalés sur de grands volumes d'éluant. Cette situation peut être prévenue en limitant strictement le volume et la masse d'échantillon injecté.

L'alternative consiste à diluer en grande partie l'échantillon avec de l'eau ou un solvant faible pour assurer une rétention adéquate.

Aucune de ces deux approches n'est entièrement satisfaisante, car la vitesse d'analyse et le rendement sont compromis. De manière alternative, dans un système avec la technique « at-column dilution », le système est reconfiguré pour que le bouchon d'échantillon soit acheminé jusqu'à l'entrée de la colonne, où il est dilué en continu avec un courant de diluant aqueux. La vitesse de transfert dans la colonne est si élevée qu'il ne peut pas y avoir de précipitation. Les molécules de l'échantillon sont ensuite absorbées sur le matériau de remplissage sous forme de bandes très étroites qui peuvent être éluées sous forme de pics de faible volume bien résolus. La robustesse du système est améliorée avec la technique « at-column dilution », car l'échantillon a une capacité limitée à précipiter dans la boucle ou en tête de colonne.

La résolution améliorée entre les pics des composés de l'échantillon permet d'augmenter la taille de l'échantillon et donc de réduire le nombre d'injections nécessaires à l'isolement. Dans la pratique, avec la technique « at-column dilution », le chargement de la colonne peut souvent être multiplié par trois à cinq. La fréquence des arrêts haute pression est réduite et la durée de vie de la colonne est allongée.

Mise à l’échelle du débit

Pour maintenir correctement la qualité de séparation pendant la mise à l'échelle, la vitesse linéaire doit rester constante entre les colonnes à petite et à grande échelle. Par conséquent, la mise à l'échelle du débit fonctionne mieux entre des colonnes à petite et grande échelle de longueur, granulométrie et matériau de conditionnement identiques. Les capacités de la géométrie des colonnes du système, telles que le débit maximal de la pompe et les limites de contre-pression, doivent être prises en compte lors de la mise à l'échelle du débit. Si la géométrie des colonnes ne répond pas aux exigences de débit, il faudra envisager d'apporter à l'instrument les modifications appropriées pour respecter l'échelle.

Équation 12 : Mise à l'échelle du débit

Par exemple, si le débit d'une colonne analytique (5 µm, 4,6 mm x 50 mm) est de 1,5 mL/min, le débit d'une colonne préparative (5 µm, 19 mm x 50 mm) est calculé :

Mise à l’échelle de la durée du gradient

En général, aucun changement de gradient n'est nécessaire pendant la mise à l'échelle si le débit est ajusté pour maintenir la vélocité linéaire de la phase mobile. Si les colonnes sont de longueurs différentes, la durée du gradient doit être calculée pour maintenir les temps de séparation et de rétention obtenus à petite échelle.

Équation 13 : Mise à l'échelle de la durée du gradient

Par exemple, un segment de gradient linéaire qui dure 5 minutes sur une colonne analytique de 50 mm durera 10 minutes sur une colonne préparative de 100 mm :

Calculateur Prep

Les calculs de mise à l'échelle de masse, de débit et de gradient peuvent également être effectués dans le Calculateur de colonnes Prep OBD. Le calculateur est une application facile à utiliser qui facilite tous les calculs de mise à l'échelle de l'analytique au préparatif, y compris la charge massique, le volume du système, les débits, la consommation de volume de solvant, les rapports du débit divisé pour la chromatographie assistée par spectrométrie de masse, et le transfert des méthodes UPLC à gradient ciblé vers les méthodes préparatives. L'application est accessible à l'adresse www.waters.com/prepcalculator ou via un logiciel de purification Waters tel que ChromScope.