Entwicklung eines fokussierten Gradienten
Die folgenden Berechnungen können verwendet werden, um einen fokussierten Gradienten für die interessierende Verbindung zu erzeugen, nachdem die Probe mit einem schnellen Scouting-Gradienten analysiert wurde. Zu jeder Gleichung folgt ein theoretisches Beispiel.
Zuerst muss das Dwell-Volumen des Systems für das Gerät bestimmt werden, das für den Scouting-Gradientenlauf verwendet wurde. Anweisungen zur Bestimmung des Dwell-Volumens finden Sie im Abschnitt „Bestimmung des Dwell Volumens “ dieser Einführung oder im Applikationstool „Analytical to Prep Gradient Calculator“ unter www.waters.com/prepCalculator.
Außerdem muss das Säulenvolumen der für den Scouting-Lauf verwendeten Säule bestimmt werden. Es kann berechnet werden, indem das Volumen eines Zylinders V = πr²h und das vom Packungsmaterial eingenommene Volumen verwendet wird, d. h. V = πr²h (66 %). Das Applikationstool „Analytical to Prep Gradient Calculator“ kann ebenfalls verwendet werden, um diese Berechnung durchzuführen.
Gleichung 1: Säulenvolumen
Säulenvolumen = π r² x Höhe x 66 % verfügbare mobile Phase/1000 zur Umrechnung von mm³ in mL
Beispiel:
CV = 3,14 x (4,6 mm/2)² x 50 mm x 0,66/1000
CV = 548 mm³ = 0,548 mL
Gleichung 2: Offset-Volumen zwischen Gradientenbildung und Detektor
Offset-Volumen = Systemvolumen* + Säulenvolumen
*Systemvolumen oder Dwell-Volumen
Beispiel:
Offset-Volumen = 1,04 mL + 0,548 mL
Offset-Volumen = 1,588 mL
Gleichung 3: Zeit bis zum Detektor
Zeit bis zum Detektor = Offset in mL/Flussrate in mL/min
Beispiel:
Zeit bis zum Detektor = 1,588 mL/1,5 mL/min
Zeit bis zum Detektor = 1,06 min
Gleichung 4: Zeitpunkt der Bildung der Elutionskonzentration
Zeitliche Elutionskonzentration = Retentionszeit des interessierenden Peaks – Zeit bis zum Detektor – Gradienten-Haltevolumen
Beispiel:
Zeitliche Elutionskonzentration = 6,0 min – 1,06 min – 0,0 min
Zeitliche Elutionskonzentration = 4,94 min
Gleichung 5: % Elutionskonzentration
% Elutionskonzentration = Zeitliche Elutionskonzentration/Länge des Scouting-Gradientensegments x Scouting-Wechsel + anfänglicher Scouting-Gradient %
Beispiel:
% Elutionskonzentration = 4,94 min/6,0 min x 90 % + 5 %
% Elutionskonzentration = 79,1 %
Gleichung 6: Anzahl der Säulenvolumina (CV)
Anzahl Säulenvolumina = 1 Säulenvolumen/mL x Flussrate mL/min x Länge des Scouting-Gradientensegments
Beispiel:
# CV = 1 CV/0,548 mL x 1,5 mL/min x 6 min
# CV = 16,4
Gleichung 7: Steigung des Scouting-Gradienten
Steigung des Scouting-Gradienten = Änderung des Scouting-Gradienten in %/Anzahl der Säulenvolumina
Beispiel:
Steigung des Scouting-Gradienten = (95 % - 5 %)/16,4 CV
Steigung des Scouting-Gradienten = 5,49 %/CV
Gleichung 8: Fokussierte Gradientensteigung
Fokussierte Gradientensteigung = 1/5 x Steigung des Scouting-Gradienten
Beispiel:
Fokussierte Gradientensteigung = 1/5 x 5,49 %/CV
Fokussierte Gradientensteigung = 1,1 %/CV
Das fokussierte Gradientensegment wird von 5 % unterhalb bis 3–5 % oberhalb des geschätzten Elutionsprozentsatzes erstellt. Der Elutionsprozentsatz beträgt beispielsweise 79 %.
Gleichung 9: Zeitdauer für das fokussierte Gradientensegment
Zeitdauer für das fokussierte Gradientensegment = % Bereich x (1/Steigung des Scouting-Gradienten) x Säulenvolumen x (1/Flussrate)
Beispiel:
Zeitdauer für das fokussierte Gradientensegment = (79 % + 5 %) - (79 % - 5 %) x (1/1,1 %) x (0,548 mL) x (1/1,5 mL/min)
Zeitdauer des fokussierten Gradientensegments = 3,32 min
Der letzte Schritt besteht darin, den fokussierten Gradienten mithilfe der in den vorherigen Formeln berechneten Werte zu schreiben.
