Präparative Flüssigchromatographie – Leitfaden

Die Probeninjektion kann bei niedrigem Durchsatz manuell erfolgen oder bei Applikationen mit hohem Durchsatz automatisiert werden. Bei der manuellen Injektion wird die Injektionsschleife eines Rheodyne-Ventils durch Drehen des Ventilgriffs aus dem Flussweg genommen. Eine filtrierte Probe wird in eine Spritze aufgezogen, eine stumpfe Nadelspitze aufgesetzt und die Luftblasen entfernt. Die Nadel wird in den Port des Injektionsventils eingeführt und die Probe in die Injektionsschleife abgegeben. Der Rheodyne-Ventilgriff wird gedreht, um die Injektionsschleife wieder in den Flussweg zu bringen. In dieser Position wird die Probe in den Flussweg gegeben.

Die Probeninjektion kann für einen hohen Durchsatz auch automatisiert werden. Autosampler mit hoher Kapazität können die Probenansaugung und -injektion auf einer einzigen Plattform verwalten. In der Aufreinigungssoftware ist ein Roboterarm konfiguriert, um die Injektion von Proben aus Mikrotiterplatten, Teströhrchen, Szintillationsvials oder herkömmlichen Autosampler-Vials zu steuern.

Injektionsschleifen

Typischerweise wird eine Injektionsschleife basierend auf der Größe des beabsichtigten Injektionsvolumens ausgewählt. Wenn das Volumen der Schleife zu groß ist, kann die Probe von der überschüssigen Oberfläche der Schleife absorbiert werden, was zu einer Verzögerung führt, oder es kann zu einer Probendispersion kommen, was beides die Qualität der Chromatographie nachteilig beeinflussen kann. Eine Schleifengröße in der Nähe des beabsichtigten Injektionsvolumens bietet die beste Reproduzierbarkeit und das beste chromatographische Profil.

Fraktionssammler

Der gewünschte Durchsatz für die Applikation bestimmt den erforderlichen Automatisierungsgrad für die Fraktionssammlung. Ein Fraktionssammler besteht aus einem Schalter und einem Probenschaltventil. Das Schaltventil wird zu einem geeigneten Zeitpunkt geöffnet, damit die Verbindungen bei der Elution gesammelt werden können.

Während die Fraktionssammlung für Applikationen mit niedrigem Durchsatz manuell durchgeführt werden kann, kann sie für höheren Durchsatz auch automatisiert werden. Der Grad der Automatisierung wird durch die Anzahl und das Volumen der gewünschten Fraktionen bestimmt. Fraktionssammler mit hohem Durchsatz kombinieren häufig Probeninjektion und Fraktionssammlung in einem Gerät, wobei ein Roboterarm verwendet wird, der mit Sonden für die Probennahme und Fraktionierung ausgestattet ist.

Sammelgefäße

Viele Aufreinigungssysteme sind für die unterschiedlichsten Formen, Größen und Volumina von Sammelgefäßen geeignet. Die gebräuchlichsten Sammelgefäße sind Reagenzgläser, Vials, Flaschen oder Trichter, die in große Gefäße abgegeben werden. Sammelgefäße müssen sauber, trocken und gegenüber der Probe und dem Lösungsmittel inert sein. Sie werden normalerweise ohne oberen Verschluss in das Gestell für die Sammelgefäße gegeben, um die Abgabe des Isolats zu ermöglichen.

Bei einigen Sammelsystemen landen die nicht gesammelten Fraktionen nicht im Abfall, sondern können in einen probenspezifischen Abfallbehälter gegeben werden. Wenn der Anwender den falschen Peak sammelt, eine ungeeignete Methode ausführt, die Zielverbindung nicht detektiert oder die Sammlung nicht ausgelöst wird, fließen die nicht gesammelten Fraktionen in einen speziellen Abfallbehälter, aus dem das Lösungsmittel verdampft und die Probe erneut gelöst und erneut injiziert werden kann.

Detektoren

Die Detektion in der Durchführung einer Aufreinigungschromatographie ist besonders zu beachten. Die vier Hauptdetektortypen, die für die Aufreinigung verwendet werden, sind UV/Vis, Brechungsindex (RI), Verdampfungslichtstreuung (ELS) und Massenspektrometrie (MS).

Detektoren können bei einer einzigen Wellenlänge detektieren, die vom Anwender eingestellt werden kann (UV/Vis), oder die Absorption über einen Wellenlängenbereich kann durch einen Photodiodenarraydetektor (PDA) erfasst werden. Der PDA wird oft während der Methodenentwicklung verwendet, um eine geeignete Wellenlänge für die interessierende Verbindung auszuwählen. Dies wird durch die Erfassung von Wellenlängen zwischen 200 und 400 nm oder höher (≥ 350 nm) erreicht, wenn im sichtbaren Bereich gearbeitet wird. Die Wellenlänge, die die maximale Signalintensität für die interessierende Verbindung bereitstellt, ist die optimale Wellenlänge für die Trennung. Die optimale Wellenlänge für eng eluierende Verunreinigungen sollte ebenfalls bestimmt werden. Andernfalls kann ein „reines Isolat“, das bei einer Wellenlänge gesammelt wurde, tatsächlich Verunreinigungen enthalten, wenn es bei einer anderen Wellenlänge beobachtet wird. In diesem Fall ist möglicherweise eine sekundäre Methodenentwicklung und -aufreinigung erforderlich, um das Isolat weiter zu reinigen.

Bei Verwendung von UV/Vis- und PDA-Detektoren kann eine hohe Empfindlichkeit bei großen Injektionsvolumina und hohen Probenkonzentrationen, die bei der Aufreinigung üblich sind, ein Hindernis sein. Daher werden Detektorflusszellen mit kurzen Weglängen (1 – 3 mm) anstelle von analytischen Flusszellen mit langen Weglängen (10 mm) verwendet.

RI-Detektoren haben einen gewissen Vorteil beim Nachweis von Komponenten mit begrenzter oder keiner UV-Absorption, wie z. B. Alkohole, Zucker, Saccharide, Fettsäuren und Polymere. Der RI-Detektor erkennt Unterschiede im Brechungsindex, um das Vorhandensein oder Fehlen einer Verbindung zu bestimmen. Der RI-Detektor wird manchmal als „Universaldetektor“ bezeichnet, da er nicht darauf angewiesen ist, dass die Verbindung ionisiert oder ein Chromaphor enthält. Ein Nachteil des RI-Detektors besteht darin, dass er nur bei isokratischen Trennungen verwendet werden kann, um die Erkennung von Gradientenstörungen zu vermeiden, die eine Basisliniendrift verursachen.

ELS-Detektoren können als Alternative zu UV/Vis- und RI-Detektoren verwendet werden. ELS-Detektoren leiten das Eluat durch einen beheizten Zerstäuber, um den Analyten zu verflüchtigen und das Lösungsmittel zu verdampfen. Das Lösungsmittel wird als Gas abgeleitet, der Analyt bildet jedoch einen Strom feiner Partikel, der zwischen einer Lichtquelle und einem Detektor hindurchgeht, der das Licht streut und den Effekt misst. Die Hauptvorteile von ELS-Detektoren bestehen darin, dass sie Verbindungen erkennen, die kein Chromaphor besitzen, und dass sie sowohl bei isokratischen Trennungen als auch bei Gradiententrennungen verwendet werden können. Ein Nachteil ist, dass ELS-Detektoren Proben zerstören. Daher kann der Detektor nicht in den Hauptflussweg geschaltet werden. Der Flussweg muss geteilt werden, damit ein kleiner Teil zum ELS-Detektor und der Rest zum Fraktionssammler geht.

MS-Detektoren identifizieren die getrennten Probenverbindungen, die aus der Säule austreten, auf Basis ihrer Masse und des Massenspektrometers. Die MS ist eine der empfindlichsten und selektivsten Methoden der molekularen Analyse und liefert Informationen über das Molekulargewicht sowie das Fragmentierungsmuster des Analytmoleküls, was für die Bestätigung der Identität des Analyten von unschätzbarem Wert ist. Es sind verschiedene Arten von MS-Systemen verfügbar, die verschiedene Arten von Schnittstellen enthalten. Die gängigsten Schnittstellen sind Elektrospray (ESI) und chemische Ionisierung bei Atmosphärendruck (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Jede Schnittstelle ist mit anderen Applikationsbereichen, Flussratenfähigkeiten, Empfindlichkeiten und Reaktionslinearitäten verbunden. Wie bei ELS-Detektoren ist die MS eine zerstörende Technik. Daher muss der Fluss gesplittet werden, damit ein kleiner Teil in den Detektor und der Hauptteil zum Fraktionssammler geht.

Flusssplitter

Bei chemisch zerstörenden Detektoren, wie z. B. bei der MS oder dem ELS, muss ein Teil des Flusses, der von der Säule kommt, vom Hauptfluss abgesplittet werden, um zum Detektor zur Fraktionstriggerung zu gelangen. Da die Detektoren einen Peak erkennen müssen, bevor der Fraktionssammler ausgelöst wird (Verzögerungszeit), muss der geteilte Fluss den Detektor erreichen, bevor der Hauptstrom den Fraktionssammler erreicht. Um dies zu erreichen, wird die gesplittete Flussgeschwindigkeit durch Verwendung einer „Make-up-Pumpe“ und eines „Zusatzlösungsmittels“ erhöht.

Flusssplitter können entweder „passiv“ oder „aktiv“ sein. Sowohl passive als auch aktive Flusssplitter sind bei der Probenahme des Hauptprobenflusses gleich effektiv, sodass die Art des verwendeten Splitters von den Präferenzen des Anwenders abhängt.

Passive Splitter beinhalten die Verwendung restriktiver Kapillaren, wie z. B. einer Verzögerungsspule und „T-Fittings“, um einen spezifischen Flussratenbereich und ein Splitverhältnis aufrechtzuerhalten.

Ein aktiver Flusssplitter hat zwei vollständig getrennte Flusswege und ein Schnellschaltventil, das einen Teil des Hauptflusses in den Zusatzfluss leitet, wo er in einem programmierten Splitverhältnis verdünnt wird.

Kapillare

Bei der Auswahl der geeigneten Kapillare für den Flüssigkeitsweg sind mehrere Aspekte zu berücksichtigen. Zum einen hängt die Sicherstellung der Integrität der Flusswegkapillaren des Systems stark von der Eignung des für die Leitungen verwendeten Materials und der Applikation ab. Die Kapillare können entweder aus PEEK (Polyetheretherketon) Hochleistungspolymer oder Edelstahl bestehen und sollten mit der Probe und der mobilen Phase chemisch kompatibel sein, um zu verhindern, dass die Probe an der Oberfläche der Kapillare klebt und zu Probenverlusten, geringer Ausbeute oder Verschleppung führt.

Die Systemkapillare sollten auch den Drücken und Betriebstemperaturen des Flusswegs standhalten können, obwohl bei der Aufreinigungschromatographie die Temperatursteuerung des Flüssigkeitswegs oft nicht verwendet wird und daher kein bedeutendes Problem darstellt.

Unter Berücksichtigung der Druckbegrenzungen können chromatographische Aufreinigungssysteme in drei Zonen aufgeteilt werden – die „Niederdruck“-Zone zwischen dem Lösungsmittelreservoir und der Pumpe; die „Hochdruckzone“ zwischen der Pumpe und dem Einlass der Säule; und eine zweite „Niedrigdruck“-Zone zwischen dem Auslass der Säule und dem Abfallbehälter oder Fraktionssammler nach dem Detektor. Die Kapillare in jeder Zone haben eigene Druckhalteanforderungen. Die Auswahl eines falschen Kapillarmaterials in einer Druckzone mit kritischen Anforderungen kann nicht nur zu schlechter Leistung und chromatographischen Problemen, sondern auch zu Undichtigkeiten und Brüchen führen.

Zwei Variablen müssen berücksichtigt werden: der Kapillarinnendurchmesser und die Kapillarlänge. Im Allgemeinen gilt: je kleiner der Innendurchmesser, desto höher die innere Geschwindigkeit und desto kleiner die Probendispersion, wodurch die Probe so konzentriert wie möglich bleiben kann. Wenn jedoch der Innendurchmesser der Kapillare abnimmt, kann der von den Kapillaren erzeugte Druck erheblich zunehmen, was zu einem Systemrückdruck führen kann, der mit der Flusszelle des Detektors oder anderen Systemkomponenten nicht kompatibel ist. Wenn Kapillare mit unterschiedlichen Innendurchmessern angeschlossen werden, kann sich an oder in der Nähe der Verbindung Totvolumen bilden. Dieses Totvolumen kann Probleme mit der Peakform und Verschleppung verursachen, da die Volumina nicht ausreichend von der flüssigen oder mobilen Phase erfasst werden.

Bei der Betrachtung der Leitungslänge ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Probe in der mobilen Phase verdünnt wird und getrennte Komponenten wieder zusammenfließen, umso größer, je mehr Volumen im Flussweg produziert wird. Die Länge der Kapillare kann auch zum Systemdruck, Verzögerungsvolumen und zusätzlichen Säulenvolumina beitragen. Um diese Probleme zu vermeiden, sollte die Länge der Kapillare angepasst werden.

Große präparative Aufreinigungssysteme arbeiten im Allgemeinen mit hohen Flussraten. Um den durch diese Flussraten verursachten Rückdruck zu mäßigen, ist es wichtig, das Aufreinigungssystem mit Kapillaren mit dem entsprechenden Durchmesser anzuschließen, um hochwertige, chromatographische Ergebnisse zu gewährleisten. Es werden verschiedene Kapillardurchmesser für Flussraten von 0,05 mL/min bis 130 mL/min angeboten.