Präparative Flüssigchromatographie – Leitfaden

Methoden-Scale-Up

Wenn der potenzielle Wert eines Isolats nachgewiesen ist, kann eine Trennmethode „hochskaliert“ werden, um steigende Mengen dieses Isolats für die weitere Evaluierung zu erzeugen. Parameter der Trennung im kleinen Maßstab, wie z. B. die Auflösung, können im großen Maßstab problemlos aufrechterhalten werden. Die Flussrate, die Probenmenge und die Systemhardware müssen geändert werden, um die Trennung mithilfe definierter mathematischer Formeln effektiv auf Säulen mit höherer Kapazität zu übertragen.

Die erste Stufe des Scale-ups umfasst normalerweise die Produktion von Milligramm- bis Gramm-Mengen des Isolats für verschiedene Applikationen, von der frühen biologischen Bewertung bis zur Erstellung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen für Produktanaloga mit verbesserten therapeutischen Eigenschaften. Weitere Stufen des Scale-ups umfassen Materialmengen von 100 g bis zu mehreren Kilogramm und darüber hinaus für die präklinische und klinische Entwicklung, die bei Erfolg schließlich zur Herstellung in großem Maßstab führen wird. Bei diesem Maßstab kommen Dokumentationen und Qualitätskontrollen wie z. B. die Good Manufacturing Practices (cGMP) ins Spiel.

Aufreinigungsmaßstab	Zielmenge	Typische Applikation
Analytische Mikro-Aufreinigung	µg	Trennung von Enzymen oder Verbindungen, die in Experimenten in kleinem Maßstab zur Wirkstoffforschung verwendet werden
Semi-Prep	mg	Biologische Tests im kleinen Maßstab, Strukturaufklärung und Charakterisierung von Metaboliten
Prep	g	Analytische Referenzstandards, Toxikologie-Scouting-Studien
Prozess	kg	Herstellung von Medikamenten und Wirkstoffen im industriellen Maßstab

Tabelle 3. Chromatographischer Maßstab, Zielmenge und zugehörige Applikation.

Der Scale-up-Workflow ist ein schrittweiser Prozess. Scale-up-Berechnungen müssen genau durchgeführt werden, da andernfalls das Endergebnis nicht die Auflösung liefern kann, die in der Trennung im kleinen Maßstab erreicht wurde. Um den Erfolg der Methodenskalierung zu steigern und die Retentionszeit und Selektivität aufrechtzuerhalten, müssen mehrere Anforderungen genau beachtet werden:

Im kleinen und großen Maßstab muss die gleiche mobile Phase verwendet werden.
Säulen mit identischer Säulenchemie, Länge und Partikelgröße ermöglichen das einfachste Scale-up (Alternativ kann die Partikelgröße geändert werden, solange das Verhältnis von Säulenlänge zu Partikelgröße L/dp der ursprünglichen Methode beibehalten wird).
Proben müssen in derselben Konzentration und im selben Diluent hergestellt werden.

Abbildung 13. Scale-up-Workflow

Bestimmung des Dwell-Volumens

Beim Scale-up oder Wechseln des Systems ist das Dwell-Volumen (Verzögerungsvolumen, Systemvolumen) wichtig für die Beibehaltung der Peakauflösung früher eluierender Peaks. Es ist definiert als das Volumen vom Punkt der Gradientenbildung bis zum Säulenkopf. Bei Hochdruck-LC-Mischsystemen umfasst dieses Volumen hauptsächlich den Mischer, die Verbindungsleitungen und die Autosampler-Schleife. Bei Niederdruck-Mischsystemen werden die Lösungsmittel vor der Pumpe gemischt, sodass zusätzliche Leitungen und das Volumen des Pumpenkopfs (oder der Pumpenköpfe) sowie der Mischer, die Verbindungsleitungen und die Autosampler-Schleife zum Gesamt-Dwell-Volumen beitragen.

Abbildung 14. Komponenten des Aufreinigungsflusswegs, die zum Dwell-Volumen beitragen, sind eingekreist (gestrichelte Linie)

Wenn die Komponenten der mobilen Phase für isokratische Trennungen online gemischt werden, ist das Dwell-Volumen immer noch vorhanden. Da die Konzentration der mobilen Phase jedoch konstant ist, ist bei der Chromatographie kein Unterschied feststellbar. Bei Gradientenmethoden hingegen wird die Konzentration der mobilen Phase im Laufe der Zeit verändert, um die Peaks zu trennen. Bei einer Gradientenmethode stellt die Kompensation des Dwell-Volumens sicher, dass die Retentionszeiten der Peaks eingehalten werden, was insbesondere beim Sammeln aufgereinigter Fraktionen wichtig ist.

Zur Bestimmung des Dwell-Volumens kann ein Stufengradient der Lösungsmittel der mobilen Phase A und B, die ein Additiv mit unterschiedlicher UV-Absorption enthalten (z. B. 0,05 mg/mL Uracil oder 0,2 % Aceton in Acetonitril), gemäß der Methode unter www.waters.com/prepCalculator im „Analytical to Prep Gradient Calculator“ verwendet werden.

1. Entfernen Sie die Säule.

2. Verwenden Sie Acetonitril als mobile Phase A und Acetonitril mit Additiv (0,05 mg/mL Uracil oder 0,2 % Aceton) als mobile Phase B.

3. Stellen Sie den UV-Detektor auf 254 nm ein.

4. Berechnen Sie die Verweilzeit zweimal (d. h.: Dwell-Volumen für die Flussrate im Originalgerät und für die beabsichtigte Flussrate mit dem Zielgerät).

5. Erfassen Sie das Signal der Basislinie bei 100 % A für 5 Minuten.

6. Programmieren Sie eine Stufe bei 5 Minuten auf 100 % B und sammeln Sie Daten für weitere 5 Minuten.

7. Messen Sie die Absorptionsdifferenz zwischen 100 % A und 100 % B.

8. Messen Sie die Zeit mit 50 % dieser Absorptionsdifferenz.

9. Berechnen Sie die Zeitdifferenz zwischen dem Start der Stufe und dem 50 %-Punkt.

10. Multiplizieren Sie die Zeitdifferenz mit der Flussrate.

Tabelle 4. Verfahren zur Bestimmung des Dwell-Volumens.

Kapazität

Bei der Aufreinigungschromatographie steht die Aufrechterhaltung einer angemessenen Auflösung für die zu sammelnde Verbindung im Vordergrund. Die Kapazität der Säule bzw. der Beladung wird anhand der Auflösung der Verbindung und der benachbarten Peaks gemessen. Obwohl die Säulenkapazität in erster Linie von der Länge und dem Durchmesser der Säule beeinflusst wird, können andere Faktoren wie die Löslichkeit und die Komplexität der Probenmischung einen Beitrag leisten. Die wichtigsten Trends zur Kapazität sind die folgenden:

Die Kapazität hängt hauptsächlich von der Löslichkeit der jeweiligen Probe ab.
Bei einfachen Mischungen ist die Kapazität höher.
Die Kapazität ist geringer, wenn eine hohe Auflösung erforderlich ist.
Die Kapazität hängt von den Bedingungen für die Beladung ab.

			Durchmesser (mm)
Länge (mm)	4,6	10	19	30	50
50	3	15	45	110	310
75	?	?	?	165	?
100	5	25	90	225	620
150	8	40	135	335	930
250	13	60	225	560	1550

Angemessene Flussrate (mL/min)	1,4	6,6	24	60	164
Angemessenes Injektionsvolumen (µL)	20	100	350	880	2450

Tabelle 5. Geschätzte Beladbarkeit (mg) für gängige Dimensionen von präparativen Säulen. Beispiel: Für die Säule mit einer Dimension von 4,6 x 50 mm beträgt die vorhergesagte Beladung 3 mg pro 20-µL-Injektion.

Die Kapazität für eine bestimmte Verbindung, die von Interesse ist, wird vor dem Scale-up der Methode durch Beladungsstudien bestimmt. Diese Studien werden in kleinem Maßstab und mit einer der folgenden Techniken durchgeführt: Es wird eine Probe mit einer hohen Konzentration hergestellt und das Injektionsvolumen schrittweise erhöht, oder es wird eine Probe mit mehreren Konzentrationen hergestellt und das Injektionsvolumen konstant gehalten. Bei beiden Techniken besteht das Ziel darin, die maximale Konzentration bzw. das maximale Injektionsvolumen zu bestimmen, die bzw. das eine angemessene Auflösung der interessierenden Verbindung von umgebenden Verunreinigungen aufrechterhält. Sobald die Säulenkapazität bestimmt ist, kann sie mithilfe einer Formel für Säulen mit größerem Durchmesser und von Workflows skaliert werden.

Abbildung 15. Studie zur Volumenbeladung. Beachten Sie die Abnahme der Auflösung des Peaks mit dem Sternchen mit steigender Beladung.

Gleichung 10: Scale-up der Konzentrationsbeladung

Um also eine Beladung mit 1800 µg (1,8 mg) auf eine analytische Trennsäule mit der Dimension 4,6 mm x 50 mm auf die entsprechende Beladung auf eine präparative Säule mit der Dimension 19 mm x 50 mm hochzuskalieren, gehen Sie folgendermaßen vor:

Gleichung 11: Scale-up des Injektionsvolumens

Zum Hochskalieren einer Beladung mit einem Injektionsvolumen von 20 µL:

Verdünnung an der Säule

Starke Lösungsmittel wie DMSO können die Löslichkeit der Probe verbessern, was zu einer möglichen Erhöhung der Säulenkapazität führt. Leider können große Injektionsvolumina von starken Lösungsmitteln die Chromatographie verzerren, was dazu führt, dass die Menge des zu isolierenden Produkts eher ab- als zunimmt.

Eine Verzerrung tritt auf, wenn starkes Lösungsmittel als eingeklemmter Stopfen in einem wässrigen Lösungsmittelstrom vom Injektor zum Säulenkopf geleitet wird. An den Rändern des Abschnitts, wo das starke Probenlösungsmittel mit dem wässrigen Lösungsmittel verdünnt wird, kann es zu Probenausfällungen kommen. Diese Ausfällung kann zu einer Blockierung des Flüssigkeitswegs und zur Abschaltung des Hochdrucksystems führen.

Abbildung 16. Verdünnung des Probenabschnitts mit mobiler Phase in der Säule. Wenn die Probe in einem starken Diluenten gelöst wird, kann es an den Rändern des Probenabschnitts zu Ausfällungen kommen, wenn dieser durch eine Säule wandert, die wässrige mobile Phase enthält.

Wenn das System durch Ausfällungen nicht abgeschaltet wird, tritt die Probe in die Säule ein. Es findet jedoch keine Retention statt, bis der Probenabschnitt mit der mobilen Phase verdünnt wurde. Bei größeren Injektionen kann das zum Verdünnen der Probe erforderliche Volumen nur abgeleitet werden, indem der Abschnitt ein erhebliches Stück entlang der Säule bewegt wird. In solchen Fällen wird die Probe als breite Bande abgelagert, die einen großen Teil des Säulenvolumens einnimmt. Das Ergebnis ist eine unvollständige Auflösung der Peaks, die sich über ein großes Volumen des Eluenten verteilen. Diese Situation kann verringert werden, indem sowohl das Volumen als auch die Masse der injizierten Probe streng begrenzt werden.

Alternativ kann die Probe auch mit Wasser oder einem schwachen Lösungsmittel stark verdünnt werden, um eine ausreichende Retention zu gewährleisten.

Abbildung 17. Herkömmlicher Ansatz zur Injektion von Proben in starkem Lösungsmittel. Der Probenabschnitt wird bei seiner Bewegung entlang der Säule verdünnt, was zu einer Verzerrung der Peaks führt.

Keiner dieser Ansätze ist völlig zufriedenstellend, da der Durchsatz und die Wiederfindung beeinträchtigt sind. Alternativ wird das System, bei dem die Verdünnung an der Säule erfolgt, so umkonfiguriert, dass der Probenabschnitt zum Eingang der Säule gefördert wird, wo er kontinuierlich mit einem wässrigen Diluenten verdünnt wird. Die Transferrate in die Säule ist so hoch, dass keine Ausfällung auftreten kann. Die Probenmoleküle werden dann als sehr schmale Banden am Packungsmaterial adsorbiert, die als gut aufgelöste Peaks mit kleinem Volumen eluiert werden können. Die Verdünnung an der Säule verbessert die Robustheit des Systems, da die Probe nur begrenzt in der Schleife oder am Säulenkopf ausfällt.

Eine verbesserte Auflösung zwischen den Peaks der Probenkomponenten ermöglicht es, die Probengröße zu erhöhen und dadurch die Anzahl der zur Trennung erforderlichen Injektionen zu reduzieren. In der Praxis kann die Säulenbeladung mit der Verdünnung an der Säule oft um das Drei- bis Fünffache erhöht werden. Die Häufigkeit von Abschaltungen unter hohem Druck wird verringert und die Lebensdauer der Säule verlängert.

Abbildung 18. System mit Verdünnung an der Säule. Der Probenabschnitt wird zum Eingang der Säule gefördert, wo er kontinuierlich mit einem wässrigen Diluenten verdünnt wird und keine Ausfällung stattfindet. Die Probenbanden eluieren als gut aufgelöste Peaks mit kleinem Volumen.

Abbildung 19. Vergleich einer in einem starken Lösungsmittel gelösten Probe mit konventioneller Injektion und einer Injektion durch Verdünnung an der Säule. 1000 µL entsprechend 133 mg wurden auf die Säule injiziert.

Scale-up der Flussrate

Um die Trennqualität beim Scale-up erfolgreich aufrechtzuerhalten, muss die Lineargeschwindigkeit zwischen kleinen und großen Säulen konstant bleiben. Daher funktioniert die Skalierung der Flussrate am besten zwischen großen und kleinen Säulen mit derselben Länge, Partikelgröße und demselben Packungsmaterial. Bei der Skalierung der Flussrate müssen die Fähigkeiten der Systemhardware wie maximale Pumpenfluss- und Rückdruckgrenzen berücksichtigt werden. Wenn die Hardware die Anforderungen an die Flussrate nicht erfüllt, sollten geeignete Änderungen der Geräte in Betracht gezogen werden, um den Maßstab zu erfüllen.

Gleichung 12: Scale-up der Flussrate

Wenn zum Beispiel die Flussrate für eine analytische Trennsäule (5 µm, 4,6 mm x 50 mm) 1,5 mL/min beträgt, wird die Flussrate für eine präparative Säule (5 µm, 19 mm x 50 mm) folgendermaßen berechnet:

Scale-up der Gradientendauer

Normalerweise ist während des Scale-ups keine Gradientenänderung erforderlich, wenn die Flussrate so eingestellt wird, dass die Lineargeschwindigkeit der mobilen Phase aufrechterhalten wird. Bei unterschiedlichen Säulenlängen muss die Gradientenzeit berechnet werden, um die erhaltene Trenn- und Retentionszeit möglichst klein zu halten.

Gleichung 13: Scale-up der Gradientenzeitskala

Ein lineares Gradientensegment, das auf einer analytischen 50-mm-Trennsäule 5 Minuten dauert, entspricht auf einer präparativen 100-mm-Säule 10 Minuten:

Prep Calculator

Massen-, Fluss- und Gradienten-Scale-up-Berechnungen können auch mit dem Prep OBD Columns Calculator durchgeführt werden. Der Rechner ist eine einfach zu bedienende Applikation, die bei allen Skalierungsberechnungen vom analytischen zum präparativen Maßstab hilft, einschließlich Massenbeladung, Systemvolumen, Flussraten, Lösungsmittelverbrauch, geteilte Flussverhältnisse bei der UPLC für die massengesteuerte Chromatographie und fokussierte UPLC-Gradientenmethoden bis hin zum präparativen Methodentransfer. Auf die Applikation kann unter www.waters.com/prepCalculator oder über eine Aufreinigungssoftware von Waters wie ChromScope zugegriffen werden.