Einführung in die präparative SFC

Hinweise zur analytischen Methode

Wenn eine analytische Methode zu Aufreinigungszwecken hochskaliert wird, ist es wichtig, dass die Chromatographie die bestmögliche für die Applikation ist. Eine bessere Auflösung im analytischen Maßstab bedeutet eine bessere Chromatographie im präparativen Maßstab, was zu einem höheren Durchsatz und reineren Fraktionen führt. Die Analysemethoden müssen auch die Bedingungen der präparativen Technik wie Säulenheizung, Injektionsmodus, Druckverluste, Systemdruck und passende Säulen berücksichtigen. Wenn die Aufreinigung durch MS erfolgt, sollten alle Screening- und Methodenentwicklungen im analytischen Maßstab ebenfalls mittels MS-Detektion erfolgen. Bei Gradientenmethoden müssen die Steigung des Gradienten und die Äquilibrierungszeit den Volumenunterschied zwischen dem analytischen und präparativen System berücksichtigen. Der Diluenteffekt muss ebenfalls berücksichtigt werden, da die analytische Beladung häufig mithilfe von Mischstrom-Injektionen erfolgt, während bei der präparativen Methode Modifikatorstrom-Injektionen verwendet werden.

Beladung

Angesichts der unterschiedlichen Injektionsstrategien werden Beladungsstudien in der Regel zuerst im kleineren (analytischen) Maßstab durchgeführt. Es ist wichtig, die Löslichkeit der Verbindungen in einer Probe zu kennen, bevor diese dem System zugeführt wird. Die beste Vorgehensweise bei präparativen Applikationen ist es, das meiste der Probe in der geringsten Menge an Lösungsmittel zu laden (hochkonzentrierte Proben). Die Probe muss jedoch auch in der Lösung bleiben, nachdem sie in die kombinierte CO₂- und organische mobile Phase injiziert wurde. Sobald eine akzeptable Konzentration bestimmt wurde, wird eine Probenbeladungsstudie durchgeführt, bei der das Injektionsvolumen schrittweise erhöht wird, bis die Auflösung verloren geht oder die Chromatographie nicht mehr zum Erhalt reiner Fraktionen der Zielverbindungen verwendet werden kann.

Allgemeine Anforderungen an eine erfolgreiche Skalierung

Sobald eine akzeptable Methode entwickelt und eine Beladungsstudie im analytischen Maßstab durchgeführt wurde, ist es ideal, wenn Retention und Selektivität beim Scale-up gleich (oder ähnlich) sind. Für eine erfolgreiche Skalierung der Chromatographie müssen mehrere Parameter konstant bleiben:

■ Die mobilen Phasen müssen identisch sein. In der SFC bedeutet dies, dass es sich um ein identisches Hilfslösungsmittel (Lösungsmittel B) handelt und dass das CO₂ von ähnlicher Qualität, ähnlichem Einlassdruck, ähnlichem Aggregatzustand (Flüssigkeit oder Gas) und ähnlicher Abgabemethode sein muss

■ Die Säulen müssen dieselbe chemische Zusammensetzung, Länge und Partikelgröße aufweisen, um die beste Möglichkeit zu bieten, die Chromatographie in unterschiedlichen Maßstäben abzugleichen. Wenn Säulen mit kleinen Partikelgrößen im analytischen Maßstab verwendet werden, muss das Verhältnis von Länge zu Partikelgröße (L/dp) zwischen den Säulen gleich sein

■ Die Proben müssen die gleiche Konzentration aufweisen und im gleichen Diluenten gelöst sein.

Geometrische Skalierung

In der Prep SFC werden, genau wie in der LC, die Injektionsvolumina (Beladung) und Flussraten geometrisch skaliert.

Um Peakform und Beladbarkeit beizubehalten, muss das Injektionsvolumen entsprechend der Säulengröße skaliert werden. Die Kapazität wird durch folgende Gleichung bestimmt:

wobei Vol das Injektionsvolumen (µL), D der Innendurchmesser der Säule (mm) und L die Säulenlänge (mm) ist.

Um die Trennqualität aufrechtzuerhalten, wird die Flussrate entsprechend den Säulendimensionen skaliert. Bei Säulen gleicher Länge und Partikelgröße ergibt sich folgende geometrische Skalierung der Flussrate:

wobei F die Flussrate (mL/min) und D der Innendurchmesser der Säule (mm) ist.

Dwell-Volumen und Extra-Säulenvolumen:

Wenn Säulen eine identische Länge haben, sind Änderungen am Gradientenprofil in der präparativen Methode basierend auf dem Dwell-Volumen erforderlich. Um diese Einstellungen vorzunehmen, muss das Dwell-Volumen sowohl des analytischen als auch des präparativen Systems bestimmt werden. Zur Bestimmung des Dwell-Volumens wird in der Regel eine Verbindung oder ein Lösungsmittel, das ein UV-Signal liefert, zum Hilfslösungsmittel hinzugefügt und ein Gradient ohne Säule durchgeführt. Anhand der Zeitverzögerung zwischen dem Gradientenstart an den Pumpen und der Signaländerung am Detektor kann das Dwell-Volumen durch Multiplizieren der Zeitverzögerung mit der Flussrate bestimmt werden (Abbildung 25).

Es ist auch wichtig, den Einfluss von Extra-Säulenvolumen wie Leitungen, Injektionsventile, Schleifengröße, Detektorflusszellen und Splitter zu beachten, das zu einer Bandenverbreiterung in der endgültigen Chromatographie führen kann. Um das Extra-Säulenvolumen und die Bandenverbreiterung zu messen, wird die Säule entfernt und eine Injektion vorgenommen. Die Zeit zwischen Injektion und Detektion ergibt multipliziert mit der Flussrate das Extra-Säulenvolumen. Die Peakform ohne Säule weist auf eine eventuelle Verbreiterung infolge des zusätzlichen Säulenvolumens hin. Da das System für die Injektion eines Modifikatorstroms angeschlossen war, erfolgte die Injektion mit 100 % Hilfslösungsmittel, damit das Volumen genauer und ohne Zusatz von CO₂ nach der Injektion bestimmt werden konnte. Einzelheiten zu diesem Verfahren sind im präparativen OBD Säulenrechner enthalten, einer Online-Anwendung, auf die unter www.waters.com zugegriffen werden kann. Der Säulenrechner ist ein einfach zu bedienendes Tool, das Sie bei allen Skalierungsberechnungen von analytisch bis präparativ unterstützt.

Mobile Phase – Hinweise zur Dichte

Die einfachen Scale-up-Regeln für die LC sind zwar bei der SFC anwendbar, können aber nicht direkt angewendet werden, da sie von einer konstanten Dichte der mobilen Phase ausgehen. Das Scale-up bei der SFC ist komplexer, hauptsächlich aufgrund der Komprimierbarkeit der mobilen Phase, die Dichte-, Druck- und Temperaturschwankungen über die Säule und zwischen den Systemen verursacht. Schwankungen dieser Faktoren haben einen Einfluss auf die Zusammensetzung und Stärke der mobilen Phase. Die resultierenden Auswirkungen auf Retention und Selektivität erschweren die Aufrechterhaltung des Trennprofils zwischen Systemen im analytischen und präparativen Maßstab.

Die Dichte- und Temperaturschwankungen können nicht direkt gesteuert werden, aber die Chromatographie kann erfolgreich über mehrere Skalen angepasst werden, indem die folgenden Methodenparameter in der SFC angepasst werden:

■ Anpassen des durchschnittlichen Drucks (und damit der durchschnittlichen Dichte) zwischen den Systemen. Der durchschnittliche Druck entspricht der Summe des Vor- und Rückdrucks geteilt durch zwei. Die Drücke können durch Ändern der Einstellung des automatischen Druckreglers entweder an den analytischen oder präparativen Geräten angepasst werden, um ähnliche Druckprofile (Dichte) über die Säule aufrechtzuerhalten. Es sollte beachtet werden, dass ein übereinstimmender durchschnittlicher Druck nicht immer ein übereinstimmendes Dichteprofil gewährleistet, die Profile jedoch eine bessere Übereinstimmung zeigen

■ Präzise Abstimmung der Zusammensetzung der mobilen Phase aus Kohlendioxid und Hilfslösungsmittel. Dies ist im Grunde eine Einheitenumrechnung zwischen Systemen von Volumendurchfluss in Massendurchfluss (beim analytischen) oder Massendurchfluss in Volumendurchfluss (beim präparativen), um äquivalente mobile Phasen zu erhalten

Bei der SFC ist die Zusammensetzung des Hilfslösungsmittels der wichtigste Parameter, der die Peakretention steuert. Daher ist eine genaue Skalierung der Zusammensetzung des Hilfslösungsmittels für das Scale-up der Methode unerlässlich. Durch Abstimmung des Massendurchflusses und der Zusammensetzung von CO₂ und des Hilfslösungsmittels auf den Säulenausgangsdruck und die Temperatur ist eine zuverlässige Skalierung von einem volumendurchflussbasierten Gerät auf ein massendurchflussbasiertes Gerät möglich.

Beispiel für das Scale-up

In diesem Beispiel wurde die Analysemethode auf dem UPC²-System mit den folgenden Parametern entwickelt (Tabelle 6).

Um eine konstante Säulenlänge und Partikelgröße beizubehalten, wurde die Säule Chiralpak IA mit einer Dimension von 21 x 150 mm mit 5-µm-Partikeln für das präparative System verwendet. Das Injektionsvolumen wurde geometrisch skaliert, sodass die Injektion von 10 µL auf der Säule mit 4,6 mm Innendurchmesser einer Injektion von 208 µL auf der Säule mit 21 mm Innendurchmesser entsprach. In diesem Fall wurde die CO₂-Pumpe des Analysesystems volumendurchflussgeregelt, während die Pumpe des präparativen Systems massendurchflussgeregelt war. Daher musste die CO₂-Flussrate der analytischen Methode in einen Massendurchfluss umgewandelt werden, bevor das geometrische Scale-up berechnet wurde. Dies wurde mithilfe der folgenden Gleichung durchgeführt.

■ CO₂-Fluss = 2,67 mL/min

■ CO₂ -Dichte = 0,89 g/mL

■ CO₂-Fluss (Masse) = CO₂-Fluss x CO₂-Dichte

■ CO₂-Fluss (Masse) = 0,89 x 2,67 = 2,38 g/min

Da das Hilfslösungsmittel normal skaliert wird (mL zu mL) und die Hilfslösungsmittel-Flussrate 0,33 mL/min betrug, betrug die analytische Gesamtflussrate 2,70 g/min bei ca. 12 % Methanol. Diese Flussrate und der Prozentsatz wurden geometrisch skaliert, was zu einer präparativen Flussrate von 56 g/min für eine Säule mit einer Dimension von 21 x 150 mm bei 12%igen Hilfslösungsmittel-Bedingungen führte.

Sobald Fluss und Zusammensetzung bestimmt waren, musste das Dichteprofil unter Verwendung des gleichen Durchschnittsdrucks an das Analysesystem angepasst werden. Der Vordruck des Analysesystems betrug 162 bar und der Rückdruck 120 bar (der Druckabfall betrug 42 bar), daher wurde der durchschnittliche Druck auf 141 bar berechnet. Da der Druckabfall beim präparativen System nur 24 bar betrug, musste der Rückdruck auf 130 bar eingestellt werden, um dem durchschnittlichen Druck des analytischen Systems zu entsprechen. Schließlich wurde auch die Temperatur auf 35 °C angepasst. Unter Verwendung dieser Parameter ist in Abbildung 26 eine erfolgreiche Skalierung der Trennung des ACQUITY UPC² auf das Prep-SFC-System dargestellt. Die Profile sind gleich, die Retentionsrate im Vorbereitungssystem nimmt jedoch geringfügig zu, wahrscheinlich aufgrund der unterschiedlichen Injektionsstrategie. Das analytische System verwendete eine Mischstrom-Injektion, während das Vorbereitungssystem eine Modifikatorstrom-Injektion verwendete.

Stapeln von Injektionen

Für viele Applikationen wird Stacked Injection (zeitlich versetzte Mehrfach-Injektion auf eine Säule, um das chromatographische Bett auszunutzen) verwendet. Stacked Injections reduzieren die Zeit zwischen den Injektionszyklen und minimieren den Lösungsmittelverbrauch. Stacked Injections verbessern außerdem den Durchsatz erheblich, da der gesamte zur Verfügung stehende chromatographische Platz für die kontinuierliche Trennung und Aufreinigung genutzt wird. Normalerweise werden Injektionen durchgeführt, während sich eine bereits injizierte Probe auf der Säule befindet (oder von dieser eluiert wird). Daher sind zur Verwendung von Stacked Injections isokratische Methoden erforderlich. Um Injektionen erfolgreich zu stapeln, muss die korrekte Zykluszeit (oder die Zeit zwischen Injektionen) bestimmt werden. Außerdem wird die Gesamtlaufzeit für die letzte Injektion in der Sequenz benötigt, um sicherzustellen, dass alle Peaksätze eluiert und gesammelt werden. Abbildung 27 zeigt, wie diese Werte ermittelt und dann auf einen Satz von Stacked Injections angewendet werden. Da die Zykluszeit etwa die Hälfte der Gesamtlaufzeit beträgt, werden zwei Injektionen durchgeführt, bevor der erste Zielpeak zu eluieren beginnt. Nach der letzten Injektion eluieren zwei Peaksätze, die gesammelt werden. In diesem Fall halbiert die Verwendung von Stacked Injections die gesamte Prozessierungszeit im Vergleich zu herkömmlichen Einzelinjektionen.

Beispiele Applikationen

Aufgrund des zuvor beschriebenen erweiterten Selektivitätsbereichs der SFC ist die Technik für eine Vielzahl von Applikationen geeignet (Tabelle 7).

Tabelle 7. Präparative SFC-Applikationen nach Marktbereichen

Unabhängig vom Marktbereich oder Ziel der Aufreinigung bietet die Prep SFC:

■ Vielfältige Selektivitäten auf einer einzigen, einfach zu bedienenden Plattform

■ Bereich der chromatographischen Skalierung

■ Höhere Produktivität und Lösungsmitteleinsparungen

■ Orthogonalität zu der Umkehrphasen-LC

■ Trennung und Aufreinigung von Verbindungen mit struktureller Ähnlichkeit

In diesem Abschnitt werden Auszüge aus Beispielapplikationen vorgestellt, um verschiedene Workflows und Applikationsbereiche zu veranschaulichen. Alle diese Applikationen können vollständig auf der Waters Website www.waters.com eingesehen werden.

Aufreinigung chiraler Verbindungen aus flüchtigen Geschmacks- und Duftstoffen mit der SFC

Eines der wichtigsten Applikationsgebiete der SFC sind chirale Trennungen. Genauso wie die Enantiomere chiraler Medikamente unterschiedliche pharmakologische Aktivitäten aufweisen, bestimmt die Stereochemie von Geschmacksstoff- und Duftstoffverbindungen den Geschmack, die Geruchsqualität und die Intensität. Die Aufreinigung dieser Verbindungen kann aufgrund ihrer Flüchtigkeit eine große Herausforderung darstellen. Die SFC bietet eine schnelle Niedertemperaturoption für chirale Geschmacksstoff- und Duftstoffverbindungen mit hoher Wiederfindung.

Hier wurden die Enantiomere von Linalool und Terpinen-4-ol aus ätherischen Lavendel- bzw. Teebaumölen mithilfe von chiraler Prep SFC mit Stacked Injections aufgereinigt. Abbildung 28 zeigt das Scale-up der Analysemethoden von der 4,6 x 250 mm AD-H Säule auf die Semi-Prep 10 x 250 mm AD-H Säule. Die Teebaumöltrennung zeigte, dass beide Terpinen-4-ol-Enantiomere vorhanden sind, während das Lavendelöl nur eines der Linalool-Enantiomere enthält. Die Parameter der Prep-SFC-Methode sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Die Methoden waren isokratisch, daher wurden Stacked Injections verwendet, um die Sammlungseffizienz zu maximieren. Auf Basis der Chromatographie betrug die Zykluszeit für das Teebaumöl ca. 3 Minuten und für das Lavendelöl 2 Minuten. Die resultierende chirale Aufeinigung mithilfe von Stacked Injections ist in Abbildung 29 dargestellt, wobei 50 mg des Teebaumöls in weniger als 40 Minuten und 30 mg Lavendelöl in weniger als 30 Minuten verarbeitet wurden.

Die Fraktionsanalyse ist in Abbildung 30 dargestellt, wobei die Reinheit für alle drei Fraktionen größer als 92 % war. Wiederfindungsstudien wurden mit racemischen Standards von Terpinen-4-ol und Linalool durchgeführt, was zu einer Wiederfindung von 70 – 80 % führte, was in Anbetracht der normalerweise recht niedrigen Wiederfindungsraten bemerkenswert ist.

Achirale Aufreinigung einer pharmazeutischen Verbindung mithilfe von MS-basierter Triggerung für die Fraktionierung

Bei der UV-geleiteten Aufreinigung können die Peaks von den Detektoren nicht unterschieden werden. Viele Verbindungen absorbieren bei derselben Wellenlänge. Bei der massengesteuerten Aufreinigung werden Fraktionen auf der Grundlage der Masse gesammelt. Dies ist ein sehr viel spezifischerer Parameter, da er zwischen dem/den Zielstoff(en) und etwaigen Verunreinigungen unterscheidet. Bei der Synthese von pharmazeutischen Wirkstoffen treten manchmal Verunreinigungen im Endprodukt auf.

Imatinib ist ein Tyrosinkinase-Inhibitor, der zur Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt wird. Hier wurden die Zwischen- und Endprodukte der Reaktion für die Synthese von Imatinib aufgereinigt. Im ersten Schritt wurde die Mischung mithilfe von drei achiralen Säulen und Methanol mit und ohne Ammoniumhydroxid-Zusatz gescreent. Die Ergebnisse des Screens sind in Abbildung 31 dargestellt. Die BEH 2-EP Säule und Methanol mit Ammoniumhydroxid wurden als die besten Methodenparameter für die Optimierung und das Scale-up ausgewählt.

Um die Trennung für das Scale-up zu optimieren, wurden getrennte fokussierte Gradienten für Intermediat und Produkt entwickelt. Die Konzentration des Hilfslösungsmittels bei der Elution wurde auf Basis der Steigung des Screening-Gradienten und der Retentionszeit für jeden interessierenden Peak berechnet. Das Intermediat eluierte mit 14 % Hilfslösungsmittel, während das Produkt mit 29 % Hilfslösungsmittel eluierte. Es wurden fokussierte 2-Minuten-Gradienten entwickelt, die auf diese Prozentsätze zentriert sind; sie beginnen 5 % niedriger und enden 5 % höher.

Für das Scale-up wurde die gleiche Säulenchemie verwendet und das Verhältnis von Länge zu Partikelgröße (L/dp) konstant gehalten. Die analytische 3 x 50 mm Trennsäule mit 1,7 µm Partikeln (L/dp = 29,4) wurde auf die 19 x 150 mm Präparationssäule mit 5-µm-Partikeln (L/dp = 30) skaliert. Die skalierte Chromatographie (fokussiert) und massengeleitete Sammlung ist in Abbildung 32 dargestellt.