Die superkritische Fluidtechnologie (SFx) ist das zugrunde liegende Konzept der SFC-basierten Aufreinigung. Waters SFx-Techniken umfassen Extraktion (SFE), analytische Chromatographie (UPC²) und präparative Chromatographie (Prep SFC). Alle diese Techniken verwenden unterkritisches oder superkritisches CO₂ als primäres Lösungsmittel. Durch den Ersatz flüssiger organischer und wässriger Lösungsmittel durch CO₂ bietet die SFx-Technologie eine orthogonale, umweltfreundliche und kosteneffektivere Alternative zur flüssigkeitsbasierten Aufreinigung. SFX gilt als „grüne“ Technologie, da sie aufgrund des Fehlens von organischen Lösungsmittelabfällen eine geringere Umweltbelastung hat. Im Vergleich zur LC-Aufreinigung bietet diese Technologie Verbesserungen bei Geschwindigkeit und Selektivität, was bedeutet, dass der Zeit- und Kostenaufwand für den Übergang von einem komplexen Ausgangsmaterial zum Endprodukt erheblich reduziert wird. Mit den jüngsten Fortschritten in der Gerätetechnologie wird die Trennleistung der SFx-Techniken für ein breites Spektrum von Aufreinigungsapplikationen voll ausgeschöpft.

Viele Substanzen benötigen extreme Bedingungen, um ihren superkritischen Zustand zu erreichen, und weisen in diesem Zustand unerwünschte Eigenschaften auf. In Tabelle 1 sind die Bedingungen des superkritischen Fluids und die zugehörigen Eigenschaften einiger ausgewählter superkritischer Substanzen aufgeführt. Im Gegensatz zu anderen superkritischen Substanzen gilt CO₂ im Allgemeinen als sicher, da es nicht entzündlich, explosiv, toxisch oder ätzend ist. Da der überkritische Zustand von CO₂ bei 31 °C und 74 bar leicht erreicht werden kann, kann die Dichte bei Temperaturen und Drücken innerhalb eines akzeptablen Bereichs verändert werden. Außerdem ist es aufgrund der relativ milden kritischen Temperatur für thermisch labile Proben geeignet. CO₂ ist auch relativ günstig, da es aus anderen industriellen Prozessen leicht zurückgewonnen werden kann. Dies bedeutet, dass es einen neutralen Einfluss auf den CO₂-Gehalt der Umwelt hat. Alle diese Vorteile machen CO₂ zur gebräuchlichsten Substanz, die in superkritischen Fluidtechnologien verwendet wird.

Ein Aufreinigungsworkflow besteht aus mehreren Schritten, deren Komplexität und Notwendigkeit je nach den Anforderungen der Applikation variieren. Grundsätzlich enthält ein SFx-Aufreinigungsworkflow die folgenden Komponenten.

Ausgangsmaterial oder Probe: Die Probe kann komplex sein, wie bei einem natürlich vorkommenden pflanzlichen Stoff, oder relativ einfach, wie ein gut charakterisierter pharmazeutischer Kandidat. Dies bestimmt, wie viel Probenvorbereitung erforderlich ist, und in welchem Umfang die Aufreinigung durchgeführt wird. Es ist auch gut, so viele Informationen wie möglich über die Probe und das eventuelle Produkt zu haben, wie z. B. thermische Stabilität, Polarität, Löslichkeit und Reaktivität, die die Behandlung dieser Probe vorschreiben.

Probenvorbereitung: Im ersten Schritt des Aufreinigungsverfahrens muss die Probe je nach Zustand des Ausgangsmaterials und Ziels bzw. des Umfangs der Applikation entsprechend vorbereitet werden. Die Probenvorbereitung kann viele Schritte umfassen, wie z. B. Schleifen, Trocknen, Extrahieren und Filtrieren oder einfach das Auflösen der Probe in der Lösung. Die superkritische Fluidextraktion (SFE) ist der erste Schritt (Probenvorbereitung) in einem SFx-Workflow. Es wird typischerweise bei Applikationen verwendet, die rohe Industrieprodukte, biobotanische Stoffe oder Naturstoffe umfassen.

Probenaufreinigung: Die Aufreinigung wird verwendet, um die Komplexität der Proben zu verringern oder ein Endprodukt auf eine bestimmte Reinheit für die Analyse oder Produktformulierung zu isolieren. Durch SFE hergestellte Proben sind in der Regel komplexe Gemische, die Zielverbindungen und Verunreinigungen enthalten. In einem SFx-Workflow ist die präparative superkritische Fluidchromatographie (Prep SFC) der zweite Schritt (Aufreinigung), bei dem ein oder mehrere Ziele aus einem Extrakt gereinigt werden. Die Prep SFC kann auch auf Proben angewendet werden, die mit vielen verschiedenen Methoden, nicht nur durch die SFE, vorbereitet wurden.

Endprodukt: Das Endprodukt ist das Endziel des Workflows. Dies können durch Analyse erzeugte Daten und Informationen, ein verfeinertes Material, das in einem Prozess verwendet wird, oder ein Endprodukt sein, das direkt verwendet werden kann. Das Endprodukt schreibt die Geräte und Methoden vor, die für einen erfolgreichen Workflow erforderlich sind. In einem SFx-Workflow werden die Analysen der Proben vor und nach der Extraktion (SFE) und deren Aufreinigung (Prep SFC) mithilfe der UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC²) durchgeführt.

Jede dieser SFx-Technologien kann bei Bedarf in Nicht-SFx-Workflows zur Vorbereitung, Aufreinigung oder Analyse verwendet werden.

Die präparative Hochleistungsflüssigchromatographie (Prep HPLC) ist seit über 20 Jahren eine der am häufigsten verwendeten Aufreinigungstechniken. Insbesondere in der Feinchemie, der Pharmazie und der Biotechnologie ist es ein beliebtes Trennverfahren, das häufig zur Aufreinigung von Produkten eingesetzt wird. Im Laufe dieser Zeit hat sich die Prep HPLC zu einer sehr effizienten und anwendbaren Technik entwickelt, insbesondere für die achirale Aufreinigung. Die Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (RP-LC) hat den Vorteil, dass sie eine quasi-universelle stationäre Phase (C₁₈) und ein allgemein anwendbares mobiles Phasengemisch aus Wasser und Acetonitril verwendet. Die RP-LC ist mit Massenspektrometrie (MS) kompatibel und die RP-LC in Verbindung mit der MS (RPLC-MS) ist in vielen Forschungsumgebungen der Standardansatz für die Aufreinigung.

Trotz ihrer Popularität hat die Prep HPLC mehrere Nachteile. Das Volumen der mobilen Phase, das benötigt wird, um eine bestimmte Masse einer Verbindung aufzureinigen, ist im Vergleich zur Gesamtprobe, die verarbeitet wird, groß. Typische Fraktionen der Prep HPLC enthalten große Lösungsmittelvolumina (sowohl organische als auch wässrige), was aufgrund der Zeit und Energie, die zum Trocknen und Herstellen des Endprodukts erforderlich ist, einen Engpass für die Produktivität darstellt.

Die bei der LC verwendeten Lösungsmittel können die Umwelt sowohl lokal (durch Verdunstung und Exposition) als auch insgesamt durch die Verbrennung des chemischen Abfalls verschmutzen. Die Normalphasen-Flüssigchromatographie (NP-LC) gilt als noch umweltschädlicher, da die mobile Phase in der Regel zu 100 % aus organischen Lösungsmitteln besteht. Aufgrund dieser Umgebungsfaktoren wird die Beschaffung und Entsorgung der bei der LC verwendeten Lösungsmittel immer kostspieliger, was einen Anreiz für lösungsmittelfreie oder umweltfreundlichere Prozesse schafft. Die SFC ist eine alternative Technik, die helfen kann, den Engpass zu mildern und betriebliche Verbesserungen zu bewirken, die den Zeitrahmen verkürzen sowie Lösungsmittelverschwendung und Kosten senken. In letzter Zeit hat der Fortschritt bei der SFC-Technik zu einem erneuten Interesse an dieser Methode als leistungsfähiges Werkzeug für die chirale und achirale Aufreinigung geführt. Die SFC ist für die Analyse und Aufreinigung eine umweltfreundlichere Alternative zur HPLC.

Die superkritische Fluidchromatographie (SFC) ist eine Chromatographietechnik, die unterkritisches (flüssiges) und superkritisches CO₂ als primäre Lösungsmittel in der mobilen Phase verwendet, normalerweise zusammen mit einem organischen Lösungsmittel. Wie bei jeder Chromatographie trennt die SFC die Komponenten auf Basis der Aufteilung der Analyten zwischen einer stationären Phase (Säule) und einer mobilen Phase (Lösungsmittel). Es gibt viele Ähnlichkeiten zwischen der HPLC und der SFC. Die SFC kann zum Beispiel sowohl mit isokratischen als auch mit Gradientenmethoden durchgeführt werden und ist mit allen Standard-Detektionstechniken wie Ultraviolett (UV), Photodiodenarray (PDA), Verdampfungslichtstreuung (ELS) und Massenspektrometrie (MS) kompatibel. Der allgemeine Workflow von der Prep SFC ist der gleiche wie bei der HPLC, einschließlich Methodenentwicklung, Scale-up, Fraktionssammlung und Reinheitsanalyse der gesammelten Fraktionen (Abbildung 3). Es ist auch in Bezug auf Wiederfindung und Reinheit mit der RP-LC vergleichbar, für einige Applikationen ist die Wiederfindung bei der SFC besser, während für andere die HPLC die bessere Lösung ist.

Die SFC nutzt im Allgemeinen die Prinzipien der Normalphasen-Chromatographie. Was die SFC von der HPLC unterscheidet, ist die Verwendung von CO₂ als Hauptkomponente der mobilen Phase, die unpolare flüssige Komponenten wie Hexane und Heptane ersetzt. Da superkritisches CO₂ eine komprimierbare Flüssigkeit ist, werden Druck und Temperatur zu wichtigen Parametern zur Steuerung der Lösungsmittelstärke, die Retention und Selektivität beeinflusst. Überkritisches CO₂ eignet sich gut für die chromatographische Aufreinigung, da es nicht brennbar und ungiftig ist und ein hohes Diffusionsvermögen, eine niedrige Viskosität und ein ausgezeichnetes Lösungsvermögen aufweist. Die SFC ist in den letzten Jahren für Aufreinigungslabore interessant geworden, da es erhebliche Vorteile in Bezug auf Lösungsmitteleinsparungen und Produktivität bietet.

Ein großer Vorteil von der Prep SFC ist der geringere Lösungsmittelverbrauch, da ein Großteil der mobilen Phase durch CO₂ ersetzt wird. Im analytischen Maßstab kann dieser Vorteil gering sein, im präparativen Maßstab ist er jedoch recht signifikant. In vielen Aufreinigungslaboren wird viel Zeit für die Entfernung des Lösungsmittels aus den gesammelten Fraktionen aufgewendet, wodurch ein Engpass zwischen der Aufreinigung einer Verbindung und dem Erhalt des gewünschten Zielprodukts oder Ergebnisses entsteht. Bei der Prep SFC wird der CO₂-Anteil der mobilen Phase beim Druckabbau entfernt, sodass nur eine geringe Menge an Hilfslösungsmittel zurückbleibt. Die resultierenden Fraktionen weisen höhere Produktkonzentrationen auf, wodurch die erforderliche Zeit für die Entfernung des Lösungsmittels und die Isolierung des Produkts reduziert wird. Die Fraktion kann direkt analysiert werden, sodass keine Probenanreicherungs- oder Konzentrationsschritte erforderlich sind. Dies ist besonders wichtig für Verbindungen, die sich unter den normalen, lang anhaltenden Trockenbedingungen schnell zersetzen.

Weitere Vorteile des geringeren Einsatzes organischer Lösungsmittel bei der SFC sind Kosteneinsparungen, Sicherheit in Bezug auf Entflammbarkeit und Toxizität sowie geringere Umweltbelastung. Es besteht ein erheblicher Kostenvorteil bei der Beschaffung und Entsorgung von Lösungsmitteln, aber auch Einsparungen aufgrund des geringeren Energieverbrauchs bei der Lösungsmittelentfernung. Die SFC kann auch die Verwendung toxischer Lösungsmittel wie Acetonitril, das bei der RP-LC verwendet wird, und aliphatische Kohlenwasserstoffe sowie chlorierte Lösungsmittel, die bei der NP-LC verwendet werden, vermeiden. CO₂ ist als Lösungsmittel relativ günstig, da es ein Nebenprodukt anderer industrieller Prozesse ist und recycelt werden kann.

Vorteile der Prep SFC: Höhere Produktivität

Bei der SFC wird die Produktivität aufgrund der niedrigen Viskosität und der hohen Diffusionsfähigkeit der mobilen Phase erhöht, was die chromatographische Geschwindigkeit und Effizienz verbessert. Abbildung 4 zeigt einen Vergleich der Van-Deemter-Kurven der HPLC, UPLC, SFC und UPC². In der Chromatographie wird die Geschwindigkeit der Trennungen teilweise davon bestimmt, wie schnell der gelöste Stoff in der mobilen Phase in die stationäre Phase hinein und aus dieser heraus diffundiert. Die Van-Deemter-Kurven für die SFC sind breiter und flacher als für die HPLC, was darauf hinweist, dass die Effizienz der Chromatographie bei steigender Flussrate (Lineargeschwindigkeit) hoch bleibt (niedrige Bodenhöhen). Bei der SFC führen die höheren Diffusionskoeffizienten direkt zu einer Chromatographie mit höherer Geschwindigkeit.

Aufgrund der geringeren Viskosität der mobilen Phase sind die Säulen- und Systemdrücke niedriger, was drei- bis viermal so hohe lineare Geschwindigkeiten als bei der HPLC und die Verwendung von Säulen mit kleineren Partikelgrößen ermöglicht. Die niedrige Viskosität führt auch zu verkürzten Äquilibrierungszeiten. Das Ergebnis sind kurze Laufzeiten mit hoher Trennleistung, was zu einer erhöhten Beladbarkeit und einer schnellen Injektionszykluszeit führt. Dies sind Schlüsselparameter zur Verbesserung der Produktivität bei präparativen Chromatographieprozessen. Reine Verbindungen können daher in kürzerer Zeit hergestellt werden, was zu einer höheren Gesamtproduktivität führt. Ein Beispiel für die Zeit- und Produktivitätseinsparungen zwischen der HPLC und der SFC ist in Tabelle 2 zu sehen.

Die orthogonale Beziehung zwischen der SFC und RP-LC bietet die Möglichkeit, die Produktqualität bei vielen Applikationen zu verbessern. Bei der RP-LC wird die C₁₈-Säule als nahezu universelle Lösung verwendet, was die Methodenentwicklung erheblich vereinfacht. Die wässrige mobile Phase schränkt jedoch den Bereich der Lösungsmittelkompatibilität und der Löslichkeit der Verbindungen ein. Die SFC hingegen funktioniert gut mit einer Vielzahl von organischen Diluenten, was zu einer größeren Kompatibilität mit Lösungsmitteln und Verbindungen führt. Sie hat auch eine große Auswahl an stationären Phasen.

Die SFC ist orthogonal zur RP-LC, da sie allgemein als Normalphasenchromatographie angesehen wird und eine Vielzahl von Trennoptionen in einem einfach zu verwendenden Chromatographieformat bietet. Insbesondere durch die Kombination von normaler Phasenselektivität und hoher Trenneffizienz hat die SFC einen Vorteil bei der Trennung von Stereo- und Positionsisomeren und strukturell ähnlichen Verbindungen. Für unpolare Verbindungen ermöglicht die Flexibilität der SFC den Einsatz von Umkehrphasensäulen (wie C₁₈), während die Zugabe von Wasser als Additiv den Applikationsbereich in den polareren Bereich erweitert. Bei Applikationen, bei denen die Verbindungen leicht abgebaut werden, ist die SFC-Aufreinigung eine ideale Alternative, da Trennungen schnell und ohne Wasser durchgeführt werden und das Trocknen der Fraktionen bei niedrigen Temperaturen und in kürzerer Zeit durchgeführt werden kann.

Die Prep SFC ist in Bezug auf Wiederfindung und Reinheit mit der RP-LC vergleichbar und es gibt eine Überschneidung bei Applikationen, die sowohl durch die SFC als auch die RP-LC durchgeführt werden können. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse einer Studie, in der eine pharmazeutische Bibliothek von Verbindungen für die Aufreinigung mittels SFC und LC untersucht wurde. Ungefähr 82 % der Verbindungen konnten durch beide Techniken aufgereinigt werden. Die Studie zeigt jedoch auch, wie sich die beiden Plattformen ergänzen. Einige Verbindungen konnten nur durch SFC (4 %) gereinigt werden, während andere nur durch LC (8 %) gereinigt werden konnten. Die Flexibilität, die sich durch die Kombination der beiden Plattformen ergibt, bietet eine größere Möglichkeit zur Optimierung der Trennung und Aufreinigung. Die SFC bietet eine zur RP-LC komplementäre Selektivität, die einen orthogonalen Ansatz bei der Methodenentwicklung und Trennung anspruchsvoller komplexer Proben ermöglicht. Durch die Durchführung einer mehrstufigen Aufreinigung über mehrere Plattformen hinweg oder durch die Verwendung einer orthogonalen Technik zur Fraktionsanalyse kann ein reineres Produkt zurückgewonnen und mehr Informationen erhalten werden. Ein Beispiel für die Aufreinigung einer Verbindung aus einer komplexen Matrix mithilfe orthogonaler LC- und SFC-Trennungen ist in Abbildung 6 dargestellt.