Manuel d’introduction à l’UPLC

En comprenant les principes chromatographiques décrits dans ce guide technique et la façon dont ils sont appliqués, il devient évident qu’il ne faut pas uniquement prendre en compte une faible granulométrie et une pression plus élevée pour maximiser les performances de séparation. Pour bénéficier des avantages chromatographiques des colonnes à particules inférieures à 2 µm, il est nécessaire de faire fonctionner ces colonnes sur un instrument spécialement conçu pour s’adapter aux pressions produites par une faible granulométrie, tout en réduisant l’étalement des bandes. Cela est impossible avec les systèmes de HPLC classiques.

Le système ACQUITY UltraPerformance LC est une solution conçue de manière holistique qui améliore les performances et la qualité des données analytiques des séparations chromatographiques en prenant en compte tous les aspects de la conception des instruments et des colonnes.

Il doit maintenant être clair que le secret des séparations en mode UPLC, c’est la combinaison des performances de l’instrument et de la colonne qui permet aux chromatographistes de tirer pleinement parti des colonnes de particules inférieures à 2 µm. Ce but est atteint en réduisant l’étalement des bandes à l’intérieur [intra-colonne] et à l’extérieur [extra-colonne] de la colonne et en permettant le fonctionnement de ces colonnes de faible granulométrie aux vélocités linéaires [et pressions] optimales [Figure 51].

Optimisation de la puissance de séparation

Afin de maximiser la puissance de séparation, il est possible de combiner l’utilisation de petites particules avec une température et une pression élevées pour développer des séparations à ultra-haute efficacité grâce à la technologie UPLC.

La figure 52A est une colonne d’UPLC unique de 1,7 µm et 150 mm de long produisant un peu moins de 40 000 plateaux à 90 °C. Une deuxième colonne a été ajoutée en série pour donner une longueur de 300 mm, ce qui donne un nombre de plateaux de 83 000 [Figure 52B]. L’ajout d’une troisième colonne en série permet d’exploiter toute la plage de pression du système ACQUITY UPLC, ce qui permet d’obtenir une colonne d’UPLC de 450 mm de long remplie de particules de 1,7 µm. Comme observé sur la figure 52C, une efficacité de 121 000 plateaux est atteinte en seulement 8 minutes.

Le gradient de puissance de séparation peut également être augmenté en utilisant la même logique. Dans cet exemple, deux colonnes d’UPLC de 150 mm de long et 1,7 µm [longueur totale de 300 mm] ont été montées en série pour améliorer considérablement les informations obtenues pour l’identification de métabolites [Figure 53]. Une capacité de pointe supérieure à 1 000 a été atteinte en un temps d’analyse d’une heure. La capacité de caractériser entièrement cet échantillon d’urine permet d’identifier les métabolites de produits pharmaceutiques candidats, de détecter et d’identifier des marqueurs de toxicité, et de détecter des toxines dans le cadre d’un suivi thérapeutique médicamenteux. Dans ce cas, la puissance de résolution, et donc la qualité du spectre de masse, sont considérablement améliorées, ce qui simplifie l’analyse des données, améliore les limites de détection et augmente la fiabilité du test.

Un seul système pour les séparations en mode HPLC et UPLC

Le système ACQUITY UPLC est conçu pour relever les défis organisationnels croissants afin d’accélérer la mise sur le marché des produits tout en conservant ou en améliorant la qualité des informations. Depuis 2004, un nombre incalculable d’d'innombrables entreprises aont adopté la technologie UPLC comme plateforme analytique de routine, remplaçant ainsi la HPLC classique.

L’adoption d’une nouvelle technologie ne se fait qu’après l’évaluation de ses capacités actuelles, mais également futures. La technologie UPLC répond à ce besoin d’évolution par l’utilisation d’un système unique offrant une compatibilité optimale avec les colonnes de granulométrie inférieure à 2 µm, tout en étant capable d’exécuter les méthodes importées de la HPLC de façon reproductible et robuste. Cela signifie qu’une seule plateforme technologique peut être utilisée indépendamment des besoins en matière de chromatographie, ce qui permet d’améliorer la productivité en simplifiant le transfert de méthodes d’un site à l’autre.

La figure 54 illustre, à titre d’exemple, la possibilité d’utiliser le système ACQUITY UPLC en tant que système de HPLC standard. Il s’agit de la méthode USP pour Excedrin [analgésique en vente libre] exécutée sur un système de HPLC classique [Figure 54A] et sur un système ACQUITY UPLC [Figure 54B]. La méthode chromatographique, les phases mobiles, l’échantillon et la colonne ont été simplement déplacés d’un instrument à l’autre. La conception optimale du système permet d’observer une efficacité et une sensibilité plus élevées pour le même test sur le système ACQUITY UPLC, sans modification de la sélectivité ou de la rétention relative.

Conclusion

Ce guide technique est conçu pour fournir au lecteur une compréhension de base des principes chromatographiques sur lesquels repose la technologie UPLC. Nous espérons que le lecteur comprend désormais les améliorations significatives en matière de résolution, de sensibilité et de vitesse qui peuvent être obtenues pour les séparations chromatographiques en réduisant les contributions d’étalement de bandes de l’instrument et de la colonne. En plus d’un étalement de bandes minimal, un tel système doit pouvoir fonctionner à la vélocité linéaire [et à la pression] optimale pour les colonnes de faible granulométrie [inférieure à 2 µm]. Le système ACQUITY UPLC a été conçu pour répondre aux besoins actuels et futurs des scientifiques spécialisés dans la séparation.

Les gains en efficacité théorique et résolution décrits dans ce guide technique ont été prédits il y a des dizaines d’années. Pour la première fois, la théorie a été mise en pratique à une échelle commerciale avec le lancement du système ACQUITY UPLC en 2004. Depuis lors, des milliers de spécialistes de la séparation dans le monde ont adopté la technologie UPLC et les avantages pratiques qu’elle peut apporter à leur entreprise. Le système ACQUITY UPLC permet aux entreprises de gérer plus efficacement leurs actifs en améliorant la qualité des informations chromatographiques et en réduisant le temps nécessaire à acquérir ces informations. Ceci favorise la productivité de l’entreprise en surmontant bon nombre des dysfonctionnements et ralentissements rencontrés dans le laboratoire de séparations analytiques. En plus de permettre des économies évidentes et significatives en termes de consommables, les séparations plus courtes et plus fiables profitent également à l’environnement car elles nécessitent bien moins de solvants organiques. 

Il est intéressant de noter que la plupart des principaux fabricants d’instruments, qui minimisaient à l’origine l’importance d’un système chromatographique capable de supporter des pressions plus élevées [en évoquant des problèmes de sécurité, de robustesse, de compatibilité des échantillons, etc. ], ont maintenant validé le besoin d’une telle plateforme LC en développant leurs propres systèmes pouvant supporter des pressions plus élevées. Bien que ces systèmes s’accompagnent de nombreux compromis [par exemple, les pressions minimales, l’étalement de bande large, les choix de détection limités, etc.], cette tendance manifeste vers des performances chromatographiques supérieures indique que les techniques séparatives continuent de progresser.

Bibliographie recommandée :

1. U.D. Neue, « HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice », Wiley-VCH [1997]
2. J.C. Aresenault et P.D. McDonald, « Beginners Guide to Liquid Chromatography », Waters [2009]
3. P.D. McDonald, « The Quest for Ultra Performance in Liquid Chromatography: Origins of UPLC Technology », Waters [2009]
4. M.P. Balogh, « The Mass Spectrometry Primer », Waters [2009]