Manuel d’introduction à l’UPLC

Un mélange d’échantillon est transféré d’un flacon dans un courant fluidique en mouvement [phase mobile]. L’échantillon est ensuite transporté par la phase mobile vers la tête d’une colonne chromatographique par une pompe haute pression. La phase mobile et le mélange d’échantillon injecté entrent dans la colonne, traversent le lit de particules et sortent, transférant le mélange séparé vers un détecteur [Figure 3].

Tout d’abord, examinons la façon dont la bande d’échantillon est séparée en différentes bandes d’analytes [la direction du débit est représentée par des flèches vertes]. La figure 4A représente la colonne au temps zéro [moment de l’injection], lorsque l’échantillon entre dans la colonne et commence à former une bande. L’échantillon illustré ici, un mélange de colorants jaune, rouge et bleu, apparaît à l’entrée de la colonne sous la forme d’une seule bande noire.

Après quelques minutes pendant lesquelles la phase mobile s’écoule de façon continue et régulière à travers les particules du matériau de remplissage, nous pouvons voir que chaque colorant s’est déplacé en bandes distinctes à des vitesses différentes [Figure 4B]. En effet, il existe une concurrence entre la phase mobile et la phase stationnaire qui veulent attirer chacun des colorants ou analytes. Remarquez que la bande de colorant jaune se déplace le plus rapidement et est sur le point de sortir de la colonne. Le colorant jaune a une plus grande affinité pour [est attiré vers] la phase mobile que les autres colorants. Par conséquent, il se déplace à une vitesse plus rapidegrande, plus proche de celle de la phase mobile. La bande de colorant bleu a une plus grande affinité pour le matériau de remplissage que pour la phase mobile. Sa plus forte attirance pour les particules le ralentit considérablement. En d’autres termes, c’est le composé le plus retenu dans ce mélange d’échantillon. La bande de colorant rouge exerce une attraction intermédiaire sur la phase mobile et se déplace donc à une vitesse intermédiaire dans la colonne. Comme chaque bande de colorant se déplace à une vitesse différente, nous pouvons séparer le mélange par chromatographie.

Transformation d’une bande chromatographique en pic

Chaque bande d’analyte spécifique est constituée de nombreuses molécules d’analytes. Le centre de la bande contient la concentration la plus élevée en molécules d’analytes ; tandis que les bords avant et arrière de la bande sont de moins en moins concentrés à mesure qu’ils interagissent avec la phase mobile [Figure 5].

Lorsque les bandes de colorant séparées quittent la colonne, elles passent immédiatement dans un détecteur. Le détecteur voit [détecte] chaque bande de composé séparée sur un fond de phase mobile [voir la figure 6]. Un détecteur approprié [UV, ELS, fluorescence, masse, etc.] peut détecter la présence d’un composé et envoyer son signal électrique correspondant à une station de données informatique où il est enregistré sous forme de pic. Le détecteur réagit aux variations de concentration des molécules d’analytes spécifiques dans la bande, le centre de la bande [le plus grand nombre de molécules d’analytes] étant interprété par le détecteur comme étant le sommet du pic.

Qu’est-ce qu’un chromatogramme ?

Un chromatogramme est une représentation de la séparation qui s’est produite chimiquement [par chromatographie] dans le système de HPLC. Une série de pics s’élevant à partir d’une ligne de base est tracée sur un axe des temps. Chaque pic représente la réponse du détecteur pour un composé différent. Le chromatogramme est tracé par la station de données informatiques [voir la figure 6]. La bande jaune a entièrement traversé la cellule de détection du détecteur ; le signal électrique généré a été envoyé à la station de données informatiques. Le chromatogramme ainsi obtenu a commencé à s’afficher à l’écran. Notez que le chromatogramme commence lorsque l’échantillon est injecté pour la première fois et qu’il commence sous la forme d’une ligne droite située près du bas de l’écran. C’est ce qu’on appelle la ligne de base ; elle représente la phase mobile pure traversant la cellule de détection au cours du temps. Lorsque la bande d’analytes jaune traverse la cellule de détection, un signal [qui varie en fonction de la concentration des molécules d’analytes] est envoyé à l’ordinateur. La ligne s’incurve, d’abord vers le haut, puis vers le bas, proportionnellement à la concentration du colorant jaune dans la bande d’échantillon. Ceci crée un pic dans le chromatogramme. Lorsque la bande jaune sort complètement de la cellule du détecteur, le niveau du signal revient à la ligne de base. La cellule de détection ne contient à nouveau que la phase mobile pure. Étant donné que la bande jaune se déplace le plus rapidement, en s’éluant en premier depuis la colonne, elle constitue le premier pic tracé. Un peu plus tard, la bande rouge atteint la cellule de détection. Le signal monte à partir de la ligne de base à mesure que la bande rouge pénètre dans la cellule, et le pic représentant la bande rouge commence à se tracer. Dans ce schéma, la bande rouge n’a pas entièrement traversé la cellule de détection. Le diagramme montre à quoi ressemblerait la bande rouge ou le pic si nous arrêtions le processus à ce moment-là. La majeure partie de la bande rouge ayant traversé la cellule, la majeure partie du pic a été tracée, comme indiqué par le trait continu. Si nous poursuivions le procédé chromatographique, la bande rouge traverserait complètement la cellule de détection et le pic rouge serait terminé [ligne pointillée]. La bande bleue, la plus fortement retenue, se déplace à la vitesse la plus lente et s’élue après la bande rouge. La ligne pointillée vous montre à quoi ressemblerait le chromatogramme terminé si l’analyse avait été menée jusqu’à sa fin. Il est intéressant de noter que la largeur du pic bleu est la plus largeimportante, car la largeur de la bande d’analytes bleue, bien qu’elle soit la plus étroite sur la colonne, devient la plus large une fois qu’elle quitte la colonne. En effet, elle se déplace plus lentement à travers le lit de matériau de remplissage chromatographique et nécessite plus de temps [et un plus grand volume de phase mobile] pour être complètement éluée. La phase mobile s’écoulant en continu à vitesse fixe, cela signifie que la bande bleue s’élargit et qu’elle est plus diluée. Le détecteur répond proportionnellement à la concentration de la bande. Par conséquent, le pic bleu a une hauteur plus faible et une largeur plus importante.

Étalement de la bande

Avant que la bande d’échantillon/analytes n’atteigne le détecteur, elle traverse plusieurs composants du système chromatographique qui participent à la distorsion et à l’élargissement de la bande chromatographique [Figure 7]. Ce phénomène est appelé étalement des bandes. Lorsque la bande d’analytes s’élargit, la largeur du pic chromatographique ainsi obtenue augmente. La bande plus large produit un effet de dilution qui engendre une diminution de la hauteur de pic accompagnée d’une perte de sensibilité et de résolution. À l’inverse, si l’étalement des bandes est réduit, des bandes chromatographiques plus étroites sont obtenues, ce qui augmente l’efficacité. Ces pics chromatographiques plus grands et plus étroits sont plus faciles à voir pour le détecteur, ce qui permet une sensibilité et une résolution plus élevées du fait d’une bande d’analytes plus concentrée. Il est donc important d’être conscient des facteurs qui influencent l’étalement des bandes lors des efforts déployés pour réduire et contrôler ces facteurs afin d’améliorer les performances chromatographiques globales.

Dans un système chromatographique, les influences de colonne et extra-colonne [tout ce qui se trouve à l’extérieur de la colonne] contribuent à l’étalement des bandes. Les sources extra-colonne incluent le volume d’injection, le chemin fluidique de l’instrument entre l’injecteur de l’échantillon et la colonne, et depuis la sortie de la colonne jusqu’au détecteur [y compris la cellule de détection] et tous les raccords inclus dans cette dernière. Les sources d’étalement des bandes dans la colonne incluent la granulométrie du matériau de remplissageconditionnement, la qualité de remplissage conditionnement du matériau dans la colonne et ses caractéristiques de diffusion en fonction de la vitesse de la phase mobile, de la taille et de la géométrie des analytes. La somme des variances (σ2) pour chacun de ces facteurs influe sur la largeur d’un pic [Figure 8].

Pour obtenir des performances significativement améliorées en chromatographie liquide, il est nécessaire de réduire les influences de l’étalement de colonne et extra-colonne à la fois. Le système ACQUITY UPLC repose sur le concept de la réduction des deux formes d’étalement des bandes de manière à pouvoir améliorer l’efficacité et la sensibilité [Figure 9].

Traitement de l’étalement des bandes [de l’instrument] extra-colonne

Pour améliorer sensiblement les performances chromatographiques, un effort technique important a été réalisé pour concevoir un instrument LC capable de s’adapter aux pressions produites par des remplissages de faible granulométrie [moins de 2 µm], tout en réduisant la dispersion du chemin fluidique de telle sorte que les performances théoriques de la colonne de séparation aient pu être atteintes. Il est également important que l’instrument soit un outil analytique fiable, robuste et précis pour une utilisation de routine en laboratoire. Pour démontrer l’importance de la conception des instruments, il faut comprendre l’impact de la dispersion du système [instrument + étalement des bandes de la colonne] sur les résultats chromatographiques.

La mesure du nombre de plateaux [N], ou efficacité, prend en compte la dispersion d’un pic. La largeur d’un pic est directement liée à la largeur de la bande d’analytes lors de son passage dans le détecteur, pendant que le sommet de ce pic est le point où la concentration en molécules d’analytes est la plus importante dans cette bande. Cette mesure est effectuée dans des conditions isocratiques.

L’équation du nombre de plateaux peut être dérivée comme montré sur la figure 10, où [Vn] est le volume d’élution du pic, [w] la largeur du pic et [a] une constante déterminée à partir de la hauteur de pic à laquelle la largeur du pic est mesurée. Chaque méthode de mesure de la largeur de pic donnera des nombres de plateaux identiques, à condition que le pic soit parfaitement symétrique. Si le pic présente un front ou une traînée, ces méthodes de mesure produiront des résultats différents.

On pense souvent à tort que le nombre de plateaux se rapporte uniquement aux performances obtenues par la colonne elle-même. Pourtant, l’étalement des bandes à partir de la colonne et de l’instrument influence également la largeur de pic à partir de laquelle le nombre de plateaux est déterminé. Pour démontrer l’influence de l’instrument lui-même sur l’étalement des bandes, une seule colonne de HPLC a été analysée sur deux instruments différents ; un système de HPLC standard [étalement des bandes = 7,2 µL] et un système ACQUITY UPLC [étalement des bandes = 2,8 µL]. Dans la mesure où la même colonne fonctionne sur les deux systèmes, la contribution de la colonne à l’étalement des bandes reste constante. L’augmentation de l’efficacité observée sur le système ACQUITY UPLC montre qu’un instrument avec un étalement de bandes moindre générera des largeurs de pic plus étroites, entraînant un nombre de plateaux plus élevé [Figure 11].

Influence de la longueur et du diamètre de la tubulure

Une fois la bande d’échantillon introduite dans le courant fluidique, elle se dirige vers la colonne. Le gestionnaire d’échantillons ACQUITY UPLC a été conçu pour réduire la distance entre l’injecteur et l’entrée de la colonne afin de limiter l’étalement des bandes. La colonne sépare la bande d’échantillon en bandes d’analytes individuelles. Les bandes d’analytes séparées par chromatographie sont ensuite transférées de la colonne au détecteur. À première vue, le diamètre interne [DI] de la tubulure reliant la sortie de la colonne et l’entrée du détecteur peut sembler de faible importance. Cependant, le diamètre interne peut avoir un impact important sur l’étalement des bandes de l’instrument [Figure 12].

Comme on peut s’y attendre, l’étalement des bandes diminue avec la diminution du diamètre interne de la tubulure. En acheminant une bande d’analytes concentrée dans un tube à grand DI, la bande deviendra beaucoup moins concentrée, ce qui produira un pic plus large et déformé et une sensibilité moindre. De plusEn outre, la friction le long des parois de la tubulure entraînera un déplacement des molécules d’analytes en contact avec les parois de la tubulure plus lent que celui des molécules au centre du tube, ce qui déformera le profil de la bande. La distance entre le centre et les bords externes de la bande d’analytes diminue à mesure que le DI de la tubulure diminue. Ceci réduit la quantité de déformation dans la bande. Il est également important de réduire la longueur de tubulure, car des longueurs excessives peuvent également déformer une bande d’échantillon.

Impact des réglages du détecteur sur l’étalement de bandes extra-colonne

En plus de l’influence de l’instrument sur l’étalement des bandes fluidiques, les paramètres du détecteur numérique relatifs à la vitesse d’acquisition et à la constante de filtre influencent également le résultat chromatographique. Ceci est particulièrement important pour les applications UPLC, dans la mesure où les largeurs de pic sont souvent très étroites [1 à 2 secondes] et que les temps d’analyse peuvent être très courts. Lors du réglage de la vitesse d’acquisition du détecteur, la sélection doit permettre l’acquisition de suffisamment de points de données sur un pic pour représenter correctement le pic. Une fréquence trop élevée du détecteur aura un impact négatif sur le rapport signal/bruit, entraînant une augmentation du bruit de la ligne de base sans augmentation de la hauteur du signal de l’analyte d’intérêt. À l’inverse, une fréquence d’acquisition du détecteur trop faible entraînera des points de données inadéquats sur tout le pic, réduisant ainsi l’efficacité chromatographique observée et compromettant la possibilité de reproduire la quantification. De plusEn outre, une constante de temps [filtre numérique] est utilisée pour lisser les points de données afin d’optimiser le rapport signal/bruit. Elle peut être utilisée conjointement avec la vitesse d’acquisition, ou indépendamment de celle-ci.

Les paramètres du détecteur deviennent de plus en plus importants à mesure que la largeur de la bande d’analytes diminue. Il faut une vitesse d’acquisition qui soit suffisante non seulement pour créer numériquement un pic de cette vitesse, mais également pour restituer correctement la séparation haute résolution obtenue dans la colonne d’UPLC, s’il existe des pics à élution proche.

À des débits plus lents, lorsque les pics sont plus dispersés dans le temps, ces réglages sont plus flexibles. Cependant, à mesure que les pics s’affinent et que l’analyse s’accélère [comme pour les séparations en mode UPLC], un paramétrage judicieux de la vitesse d’acquisition et de la constante de temps doit être maintenu [Figure 13]. Lors de l’utilisation de la technologie UPLC pour des applications « réelles », il est judicieux de sélectionner la fréquence d’acquisition [en Hz] des données du détecteur qui capture avec précision la finesse du pic le plus étroit, puis d’appliquer une constante de temps de filtrage [en secondes] permettant d’obtenir un rapport signal/bruit optimal et une résolution optimale de l’analyse.