Enfoques prácticos para el aislamiento de péptidos

Column Selection (Selección de columnas)

Idealmente, el uso de una química de columna para todas las muestras, incluidos los péptidos comunes (con una mezcla de residuos ácidos, básicos y no polares), los péptidos básicos, los péptidos grandes (30-40 residuos) y los péptidos hidrofóbicos, reduce el inventario de la columna y elimina la necesidad de analizar varias columnas para cada muestra bruta. Aunque las fases C₁₈ se suelen utilizar en muchas separaciones de péptidos, la partícula base a la que se une C₁₈ también es un factor crítico que influye en la retención cromatográfica, la resolución y la forma de los picos. Las columnas XBridge Peptide BEH se basan en partículas híbridas con puentes de etileno y no en sílice pura. La partícula BEH (híbrida con puente de etilisiloxano/sílice) (figura 7) reduce las interacciones secundarias con los péptidos y es estable tanto con pH alto como con uno bajo para obtener una flexibilidad máxima en el desarrollo de separaciones. El material de relleno sintético está disponible con poros de 130 Å o 300 Å en tamaños de partículas de 3,5, 5 y 10 µm. Para muestras atípicas o péptidos extremadamente hidrofóbicos, la misma partícula base está disponible con fases unidas C₈ o C₄.

En la tabla 1 se muestran las capacidades aproximadas de carga de masa de péptidos en varias dimensiones de columna.

Tabla 1. Capacidad aproximada de carga de masa de péptidos para la fase reversa

*Columnas preparativas OBD de 5 µm y 10 µm; ** Columnas preparativas OBD de 10 µm.

Son muchos los factores que afectan a la capacidad de masa de las columnas preparativas. Las siguientes capacidades representan un cálculo promedio con caudales y volúmenes de inyección razonables para cada dimensión. Los siguientes factores merecen tenerse en cuenta:
1) La capacidad para los péptidos depende principalmente de la solubilidad de la muestra específica.
2) La capacidad es menor cuando se requiere una mayor resolución.
3) La capacidad depende de las condiciones de carga, pero menos que para las moléculas pequeñas.
a) Los péptidos se suelen cargar en condiciones muy acuosas, a menudo con la adición de TFA. La capacidad de carga de volumen en estas condiciones es prácticamente ilimitada. La capacidad está limitada por la solubilidad durante la elución.
b) Los péptidos liofilizados se pueden humedecer con eluyentes como DMF o DMSO. Después, se suelen diluir con agua que contiene TFA, como se indicó anteriormente.
c) En algunos casos, los péptidos se disolverán en DMF o DMSO y se inyectarán en esa solución. Las pautas de volumen del gráfico se aplican a esta condición.
4) Los volúmenes de inyección razonables se basan en el diámetro de la columna a una longitud de 50 mm con eluyentes relativamente fuertes. Una mayor longitud es compatible con un mayor volumen de inyección, pero no de manera proporcional. Los eluyentes más suaves aumentan significativamente el volumen de inyección.
5) Los caudales razonables se basan en el diámetro de la columna. Los sistemas se verán limitados por el aumento de la contrapresión a medida que aumente la longitud y disminuya el tamaño de las partículas. Algunos usuarios prefieren analizar los péptidos más lentamente que las moléculas pequeñas, por lo que utilizan la mitad del caudal sugerido pero la duración del gradiente es el doble.

Se definió la idoneidad de XBridge Peptide BEH C₁₈ de 130 Å como la columna de elección para aislar péptidos estándar mediante los resultados obtenidos después de analizar un grupo de cuatro péptidos con diferentes propiedades. Las secuencias de péptidos son patentadas, pero las propiedades destacadas de cada péptido se indican en la tabla 2.

Tabla 2. Propiedades del grupo de prueba de péptidos.

Los péptidos tienen comportamientos anfipróticos debido a la presencia de grupos funcionales débilmente ácidos (ácido carboxílico) y débilmente básicos (aminoácidos). Debido a que los péptidos tienen cargas tanto positivas como negativas, se denominan iones dipolares (zwitteriones). Si un péptido se somete a un campo eléctrico cuando se disuelve en una solución con una concentración específica de iones hidrógeno y no migra, esa concentración de iones hidrógeno es el punto isoeléctrico (pI) del péptido. Por tanto, para simplificar, el punto isoeléctrico (pI) es el pH al que el péptido tiene carga neta cero.

Como describen Browne, Bennet y Solomon, el índice de HPLC predice el porcentaje de acetonitrilo necesario para eluir el péptido de una columna C₁₈ µBondapak utilizando TFA:agua:acetonitrilo como sistema de solución tampón. Aislaron péptidos de matrices biológicas y predijeron el perfil de elución basándose en la composición de aminoácidos. Por lo tanto, los valores altos del índice de HPLC sugieren un aumento de la hidrofobia en una columna C₁₈. Obviamente, los valores cambiarán con diferentes columnas y fases móviles, pero este sencillo sistema proporciona cierta información predictiva sobre la naturaleza de los péptidos.

En la figura 8 se muestran los perfiles cromatográficos de los cuatro péptidos en el grupo de prueba, en condiciones muy comunes: 0,1 % de ácido fórmico en agua y en acetonitrilo con un gradiente de 5-50 % de B en 50 minutos. Los cuatro péptidos del modelo muestran una cromatografía perfectamente aceptable con picos simétricos y bien definidos.

Es importante considerar si habría alguna mejora cromatográfica para los péptidos grandes o hidrófobos utilizando una columna con un tamaño de poro de 300 Å. El péptido más grande en el grupo de prueba de péptidos, con 39 residuos y un peso molecular superior a 4000 Da, muestra poca mejora en la forma de los picos con el material de relleno de tamaño de poro más grande (figura 9). El péptido eluye ligeramente antes, siendo la diferencia equivalente a aproximadamente un 1-2 % de acetonitrilo. Habrá algún límite de tamaño para el uso del material de relleno con un tamaño de poro de 130 Å. Lo más probable es que esté por encima de aproximadamente 40 residuos.

El péptido hidrófobo, con un índice de HPLC de 113, también eluye como un pico simétrico y bien definido en los materiales de relleno de 130 Å y 300 Å (figura 10). La conformación del péptido, la forma en que el péptido se pliega en la solución, también puede influir en la mejor elección del tamaño de poro para una separación específica. Del mismo modo que no existen reglas concretas para la capacidad de carga de los péptidos, las propiedades individuales de los mismo también influyen a la hora de decidir cuál es el mejor tamaño de poro a usar. A partir de los experimentos comentados anteriormente, se puede sugerir que las columnas XBridge Peptide BEH, con fase unida a C₁₈ y área de poros de 130 Å, son una elección razonable como punto de partida para aislar péptidos.

Desde el punto de vista de la economía y la eficacia durante el aislamiento de péptidos a mayor escala, es importante tener en cuenta el tamaño de las partículas. El péptido básico, analizado en tres columnas de tamaños de partículas diferentes, ilustra la consistencia de la separación (figura 11). Aunque los picos son más anchos y peor resueltos con el tamaño de partícula más grande, para los materiales de relleno de columnas BEH escalables, la selectividad química no cambia si el tamaño de partícula es de 3,5, 5 o 10 µm. Los aislamientos a gran escala se benefician de un mayor tamaño de partícula, lo que permite caudales más rápidos en columnas de diámetro cada vez más ancho con límites de presión manejables, todo lo cual mejora la capacidad de carga, reduce el número de análisis cromatográficos y ahorra tiempo y recursos.

Aunque los péptidos tienen propiedades únicas que influyen en el éxito de su aislamiento a partir de mezclas brutas, se siguen aplicando los principios básicos de la cromatografía preparativa. Si bien el protocolo estándar de aislamiento de péptidos con un gradiente genérico (como 5-50 % de B o 5-95 % de B) en una columna de fase reversa se puede utilizar la mayor parte del tiempo, los péptidos con propiedades únicas a veces precisan del desarrollo de un método de separación para cumplir los requisitos de pureza, carga o rendimiento. A menudo, los métodos de separación se pueden mejorar cambiando el eluyente de la fase móvil, el modificador, la pendiente del gradiente, la temperatura, el pH o el método de introducción de la muestra. Cada uno de estos factores afecta a la separación, la calidad de la cromatografía y el éxito final del aislamiento.

Función del eluyente

La fase móvil consta de tres componentes: el eluyente suave, el eluyente fuerte y el modificador. En la cromatografía en fase reversa, el eluyente suave casi siempre es agua. Aunque se puede considerar el uso de metanol, etanol o isopropanol para cumplir la función de eluyente fuerte, el acetonitrilo suele ser el eluyente de elección debido a su baja viscosidad, una concentración ligeramente mayor del eluyente y su facilidad de uso en el intervalo de detección UV de longitud de onda baja (185-205 nm). El acetonitrilo suele proporcionar la mejor forma de los picos, es fácil de evaporar y reduce el número de reacciones secundarias que pueden producirse durante el aislamiento y el tratamiento. Una buena transparencia a la luz UV proporciona una alta relación señal-ruido para una mejor detección de los picos. Sin embargo, algunos usuarios pueden oponerse al uso de acetonitrilo si desean utilizar el péptido en la evaluación biológica.

La sustitución de un alcohol, como el etanol, reduce la toxicidad residual que puede estar asociada con el acetonitrilo. Además de las preocupaciones sobre la biocompatibilidad, las mezclas de propanol o acetonitrilo:propanol a menudo aumentan la solubilidad de péptidos grandes o hidrófobos y separan los agregados que a veces se forman en la solución. En la figura 12 se muestra el efecto del isopropanol al 70 %:acetonitrilo al 30 % sobre el péptido básico. La resolución del pico principal mejora con respecto a los contaminantes que eluyen más cerca y el tiempo de retención se reduce aproximadamente a la mitad. Normalmente se requieren temperaturas de columna elevadas con fases móviles que contienen alcoholes debido a su mayor viscosidad.

Función del modificador de fase móvil

El aislamiento de péptidos mediante cromatografía en fase reversa requiere la adición de un modificador polar a la fase móvil, ya que los péptidos tienen cargas tanto positivas (amino-terminal) como negativas (carboxilo-terminal) que reducen la afinidad por la superficie hidrófoba del material de relleno. Los grupos protectores de la cadena lateral también pueden tener una carga, como se muestra en la figura 13. Los modificadores controlan el pH para cambiar el grado de ionización de las cadenas laterales débilmente ácidas o básicas. El modificador también puede formar pares iónicos con el péptido. La separación de una muestra específica se puede optimizar manipulando estos mecanismos.

El ácido fórmico reduce el pH de la fase móvil, con lo que se protonan las cadenas laterales ácidas del péptido y se elimina parte de la carga negativa (figura 14). El número reducido de cadenas laterales de aminoácidos cargadas aumenta la atracción hacia la superficie hidrófoba de la columna, lo que favorece una mejor separación. Aunque la mayoría de los silanoles de la superficie de la columna también pueden estar protonados, los silanoles libres seguirán estando disponibles para unirse al péptido. Estas interacciones péptido-silanol aparecerán como picos con cola en el cromatograma.

El ácido trifluoroacético (TFA), el modificador más utilizado, se diferencia en el mecanismo de interacción de la columna y la muestra (figura 15). El pH bajo protona las cadenas laterales de los péptidos ácidos y el emparejamiento iónico neutraliza las cadenas laterales básicas, lo que inhibe su unión a los silanoles libres que causan la cola de los picos. La combinación de carga reducida y emparejamiento iónico aumenta la retención, lo que requiere una mayor concentración de eluyente orgánico para la elución.

La ventaja de utilizar una columna que tenga la partícula híbrida de etilo con puente es la eliminación de las interacciones de silanol (figura 16). Ya no se necesita el TFA para reducir las colas de los picos porque el material de relleno de la base tiene menos interacciones con el péptido. En su lugar, se puede utilizar ácido fórmico (FA) o TFA para cambiar la selectividad de la separación a la vez que se mantiene una buena forma de pico. La diferencia en la retención, así como el cambio en el orden de elución, se pueden utilizar para ajustar las condiciones de purificación, como se muestra en la figura 17. El asterisco identifica el mismo péptido contaminante en las dos separaciones, lo que confirma el cambio considerable y útil en la selectividad.

Función del pH elevado

También se puede elevar el pH para cambiar la interacción entre el péptido y la superficie de la columna híbrida de etilo con puente. Con soluciones tampón como el bicarbonato amónico, el pH alto desprotona e ioniza las cadenas laterales del péptido ácido (figura 18). El bicarbonato amónico también desprotona y neutraliza las cadenas laterales del péptido básico, lo que reduce la carga del péptido y aumenta su atracción hacia la superficie de la columna hidrófoba. Las cadenas laterales del péptido básico no se unen a los pocos silanoles residuales restantes y se reducen las colas de los picos. Además de estas ventajas, el bicarbonato amónico es volátil y relativamente fácil de eliminar del producto peptídico purificado. El hidróxido amónico, al 0,1 %, también se puede utilizar para elevar el pH de la fase móvil y se evapora fácilmente de las fracciones recogidas.

Los extremos de pH cambian la selectividad de las separaciones (figuras 19 y 20). El péptido ácido (figura 19) se retiene mejor en el material de relleno de fase reversa a pH bajo porque todas las cargas negativas se neutralizan y el péptido interactúa fuertemente con la superficie de la columna hidrófoba. Por el contrario, con pH alto, el péptido pasa a un tiempo de retención más temprano debido a un mayor número de cargas negativas, que impiden que se adhiera con tanta fuerza al material de relleno de la columna. Para este ejemplo, la forma de los picos no se ve afectada, pero el cambio en el orden de la elución podría utilizarse en el desarrollo de métodos o para caracterizar el péptido con una estrategia ortogonal.

El péptido básico (figura 20) muestra el comportamiento opuesto en los extremos de pH, tal y como se esperaba. Con pH alto, los residuos básicos del péptido se desprotonan y no se ionizan. La fuerte interacción del péptido con la columna requiere un mayor porcentaje de fase móvil orgánica para eluirlo de la columna. El cambio en la selectividad, con una resolución mejorada a pH 10, hace que el pH más alto sea más atractivo para el objetivo final de aislar el péptido con mayor pureza.

Recordatorio: aunque las fases móviles con pH bajo y alto son compatibles con las columnas con tecnología de partículas híbridas, las condiciones del método en los extremos de pH no deben utilizarse con materiales de relleno de columnas de sílice. Un pH excesivamente bajo escindirá la fase unida. Un pH alto destruirá el sustrato de la columna de partículas de sílice. Se deben comprobar siempre los límites del intervalo de pH sugeridos por el fabricante para columnas específicas de sílice.

Función de la temperatura

El control de la temperatura se suele utilizar en cromatografía para garantizar separaciones reproducibles. En el aislamiento y la purificación, es valioso por varias razones más. Los péptidos hidrófobos que tienen una solubilidad limitada se encuentran entre las muestras más difíciles de purificar. El incremento de la temperatura de separación aumenta la solubilidad de los péptidos hidrófobos y normalmente mejora la forma de los picos cromatográficos. En última instancia, mejora la pureza y la recuperación del aislamiento, lo que hace que este sea más rápido y más eficiente.

Debido a que temperaturas distintas proporcionan una selectividad cromatográfica diferente, el calentamiento de la columna es una herramienta muy práctica para optimizar la separación de una muestra específica. Además, la viscosidad de la fase móvil y la presión total del sistema se reducen a temperaturas elevadas. La presión más baja del sistema reduce la tensión en el sistema, los conectores y la columna y, por último, aumenta la robustez de la operación.

Si bien el control de la temperatura en la cromatografía analítica es rutinario, de manera poco frecuente, la temperatura se emplea como parámetro para manipular la cromatografía en la escala preparativa por dos motivos. En primer lugar, las columnas de gran diámetro no se pueden calentar uniformemente desde el exterior. En segundo término, las separaciones con caudales elevados se producen realmente a la temperatura del eluyente entrante. Las capas eléctricas y los hornos de columnas, aunque son adecuados para separaciones a pequeña escala, no pueden calentar de manera uniforme columnas grandes. Se forman gradientes de temperatura a lo largo del diámetro y la longitud de la columna, lo que afecta negativamente a la cromatografía.

El calentamiento efectivo de la columna se logra insertando un loop de precalentamiento de eluyente en el cabezal de la columna y sumergiendo por completo el loop y la columna en un baño de agua equilibrado a la temperatura deseada (figura 21). El flujo continuo de eluyente a través del loop de precalentamiento equilibra internamente la columna, mientras que el baño de agua estabiliza el entorno externo de la columna. La cantidad de ensanchamiento de banda atribuida al loop de precalentamiento del eluyente es insignificante porque está construido con un tubo de diámetro interno estrecho. La muestra entrante también se vuelve a centrar mediante la adsorción en el cabezal de la columna.

Se muestra el efecto de usar el control de temperatura para las separaciones de péptidos para dos de los péptidos del grupo de prueba: el péptido básico (figura 22) y el péptido ácido (figura 23). En estos ejemplos (resaltados en rojo), los componentes de la muestra del péptido básico se separan mejor a 60 °C, mientras que los componentes de la mezcla bruta de péptidos ácidos se resuelven mejor a 40 °C. Sin embargo, estas observaciones son pura coincidencia, ya que predecir la temperatura óptima para los péptidos ácidos o básicos es casi imposible y dependerá de las propiedades específicas de las secuencias individuales.

El cambio del eluyente, el modificador de fase móvil, el pH y la temperatura afecta drásticamente a las separaciones de péptidos y cualquiera de estos parámetros se puede utilizar de manera independiente o junto con otros como herramientas del desarrollo de métodos para optimizar la cromatografía. La elección de una sola columna llena de partículas híbridas estables, como la tecnología de columnas XBridge Peptide BEH, puede simplificar el proceso de purificación al reducir el número de columnas y el tiempo de screening necesarios para el aislamiento del péptido. La cromatografía del péptido básico en la figura 24 ilustra la repercusión que tienen los pequeños cambios en la separación. En aquellos péptidos con propiedades únicas, otras químicas de columna pueden ser útiles para optimizar su separación.

Focalizar el gradiente

Las separaciones cromatográficas para el aislamiento y la purificación se rigen por los mismos principios físicos y químicos que las separaciones analíticas. Sin embargo, en los experimentos preparativos, los científicos aíslan compuestos con cargas de masa elevadas, a menudo en columnas grandes, y requieren una mejor resolución para optimizar la pureza y la recuperación del producto recogido. Crear un gradiente superficial es una buena primera estrategia para optimizar la resolución, pero cambiar la pendiente del gradiente para toda la separación puede ampliar los picos y aumentar el tiempo total de análisis. Los gradientes segmentados y focalizados disminuyen la pendiente del gradiente solo para la parte de la separación que requiere mayor resolución, sin aumentar el tiempo de total de análisis (figuras 25 y 26).

Los gradientes lineales progresan de una composición orgánica baja a una alta (es decir, 5-50 % de B o 5-95 % de B) en el transcurso de un período definido y, a menudo, se utilizan para el screening de muestras. También se pueden utilizar para la cromatografía preparativa si hay una buena resolución entre los componentes de la muestra y el tiempo de análisis es razonablemente corto. Los gradientes segmentados mantienen la misma pendiente antes y después de la parte más superficial y focalizada del método, y conservan el perfil cromatográfico de estas partes de la separación. La parte más superficial y focalizada del cromatograma tiene una pendiente de gradiente reducida, lo que aleja eficazmente las impurezas que eluyen muy cerca del pico de interés.

Los gradientes focalizados solo están destinados al producto. La fuerza del eluyente aumenta rápidamente desde las concentraciones bajas utilizadas para la carga de la muestra hasta aproximadamente un 5 % por debajo del punto de elución esperado para el pico del producto. En general, la parte superficial del cromatograma avanza aproximadamente a un quinto de la pendiente de la separación original hasta aproximadamente un 3 % por encima de la elución esperada para el pico del producto. Una vez que se completa la parte superficial del gradiente, el porcentaje de fase móvil orgánica aumenta rápidamente para lavar la columna de cualquier contaminante restante. Debido a la complejidad de las mezclas de péptidos, a menudo la mejor resolución es cercana al 0,25 %-0,33 % de cambio por volumen de columna, una pendiente ligeramente más superficial que la típica quinta parte de la pendiente del gradiente de screening original que se emplea para moléculas pequeñas y muestras de péptidos menos complejas.

El volumen del sistema se utiliza para diseñar el gradiente focalizado, así como para el escalado básico desde la escala analítica hasta la escala preparativa. El volumen del sistema, también llamado volumen de retardo o volumen muerto, se define como el volumen desde el punto de formación del gradiente hasta el cabezal de la columna e incluye todos los componentes de la trayectoria del flujo de HPLC, los cabezales de la bomba, los amortiguadores de pulsos, los mezcladores, el loop del inyector y los tubos. En el escalado geométrico, en que la pendiente se conserva tanto en la escala analítica como en la preparativa, el volumen del sistema impone una retención isocrática antes de que comience el gradiente. Esta retención puede ser de varios volúmenes de columna a pequeña escala o una fracción del volumen de columna a gran escala. Se utiliza una retención isocrática programada en las condiciones iniciales para compensar la diferencia de volumen del sistema entre las escalas analítica y preparativa, garantizando así que el gradiente real comience exactamente al mismo tiempo.

Con un gradiente escalonado (tabla 3) en el que el eluyente de la fase móvil A es puro y el eluyente de la fase móvil B contiene un absorbente de UV adecuado (es decir, acetona a 2 mL/L), el volumen del sistema se puede calcular fácilmente mediante el procedimiento y los cálculos que se muestran en las figuras 27 y 28.

Tabla 3. Gradientes escalonados para la determinación analítica y preparativa del volumen del sistema.

Aunque es posible calcular el volumen del sistema, el volumen de la columna y el porcentaje de eluyente fuerte que eluye el péptido y, después, crear el gradiente segmentado o focalizado a partir de estas estimaciones para ahorrar tiempo, es útil determinar el volumen del sistema de forma experimental y registrar los valores para experimentos posteriores. El volumen del sistema permanecerá constante siempre que no se realicen modificaciones en las conexiones de tubos de HPLC y el caudal del método sea idéntico al utilizado para medir el volumen del sistema. Una vez que el volumen del sistema se determina experimentalmente, las modificaciones en el sistema (como cambiar el tamaño del loop del inyector) se calculan fácilmente y no requieren otra medición de volumen. Una vez que se determina el volumen del sistema, se puede utilizar en cálculos de gradiente focalizados.

Diseño del gradiente focalizado

Los gradientes focalizados se suelen diseñar basándose en el análisis de la mezcla de muestra bruta, pero el procedimiento es idéntico para modificar un gradiente que ya se haya utilizado en un análisis preparativo inicial. Con las ecuaciones que se muestran a continuación, crear un gradiente focalizado es sencillo. Suponiendo que el siguiente gradiente es a partir del cual se diseñará el gradiente focalizado: columna de 4,6 x 100 mm, volumen del sistema 1,0 mL, volumen de columna 1,097 mL*
Tiempo de retención del pico = 7,76 min

*El volumen de la columna se puede determinar utilizando una calculadora disponible en la web o utilizando el volumen de un cilindro: V = πr2h. Los valores serán ligeramente diferentes según el método elegido, ya que algunas calculadoras reducen el volumen de líquido para tener en cuenta el material de relleno de la columna. Si siempre se utiliza el mismo método para todos los cálculos, no repercutirá en la cromatografía.

En la figura 29 se muestra el cromatograma del péptido sintético bruto analizado con este gradiente.
Calcular la compensación entre el punto de formación del gradiente y el detector

Compensación = Volumen del sistema + Volumen de columna

Ejemplo:
Compensación = 1,0 mL + 1,097 mL
Compensación = 2,097 mL
Calcular el tiempo que tarda el eluyente en llegar al detector
Tiempo hasta el detector = Compensación en mL
Caudal en mL/min

Ejemplo:
Tiempo hasta el detector = 2,097 mL/1,46 mL/min
Tiempo hasta el detector = 1,43 min

Calcular el tiempo en el que se formó la concentración de elución del pico

Tiempo de concentración de elución =
Tiempo de retención del pico – Tiempo hasta el detector – Retención del gradiente

Ejemplo:
Tiempo de concentración de elución = 7,76 min – 1,43 min – 0,00 min
Tiempo de concentración de elución = 6,33 min

Calcular el % de elución del pico

% de concentración de elución =
Tiempo de concentración de elución/Longitud piloto x Cambio piloto/
Segmento de gradiente + % de gradiente piloto inicial/Segmento de gradiente

Ejemplo:
% de concentración de elución = 6,33 min/10 min x 45 % + 5 %
% de concentración de elución = 33,48 %

NOTA: Para todos los cálculos que incluyan porcentajes, utilizar únicamente valores absolutos, es decir, 45 x 6,33 min, no 0,45 x 6,33.

Calcular la pendiente del gradiente piloto en % de cambio por volumen de columna

N.º volúmenes de columna (CV) =
1 CV x Caudal en mL x Tiempo del segmento de gradiente x mL min

Ejemplo:
N.º volúmenes de columna = 1 CV x 1,46 mL x 10 min/1,097 mL min
N.º volúmenes de columna = 13,3 CV

Ejemplo:
Pendiente del gradiente piloto = % de cambio del gradiente piloto
Pendiente del gradiente piloto = 45 %/13,3 CV = 3,38 %/CV

Calcular la pendiente del gradiente focalizado en % de cambio por volumen de columna. Utilizar una quinta parte de la pendiente del gradiente piloto.

Pendiente del gradiente focalizado en %/CV = 1/5 x Pendiente del gradiente piloto

Ejemplo:
Pendiente del gradiente focalizado = 1 x 3,38 %/5 CV
Pendiente del gradiente focalizado = 0,67 %/CV

Crear un segmento de gradiente focalizado desde un 5 % por debajo hasta un 3-5 % por encima del porcentaje de elución estimado. El pico eluye al 33,5 % de acetonitrilo. El gradiente superficial debe ir del 28 % al 36 % de acetonitrilo. Calcular el tiempo para el segmento de gradiente focalizado.

Tiempo del segmento de gradiente focalizado =
% de cambio x Pendiente del gradiente focalizado x Volumen de la columna x Caudal en mL

Ejemplo:
Tiempo del segmento de gradiente focalizado =
8 % x 1 CV/0,67 % x 1,097 mL/1 CV x 1 min/1,46 mL
Tiempo del segmento de grad. focalizado = 9,0 min

Escribir el gradiente focalizado comenzando por las condiciones iniciales del análisis piloto y aumentando rápidamente hasta un 5 % por debajo del % de elución del pico.

El panel superior de la figura 30 muestra el cromatograma del péptido bruto analizado utilizando el gradiente focalizado. Las impurezas que eluyen muy cerca se resuelven mejor, pero la disminución de la pendiente a aproximadamente una décima parte de la pendiente inicial (panel inferior) proporciona la mejor resolución de las impurezas. Este ejemplo ilustra claramente la repercusión que puede tener la reducción de la pendiente entre un 0,25 y un 0,33 % de cambio por volumen de columna en la separación de una mezcla de péptidos compleja. Obsérvese que el tiempo de retención del pico del péptido principal sigue siendo de aproximadamente 7 minutos, más o menos el mismo tiempo que para el gradiente de screening original. Por lo tanto, focalizar el gradiente aumentaba la resolución sin incrementar el tiempo de análisis. Aunque el tiempo total de análisis para el gradiente total es más largo, se pueden utilizar otras técnicas, como la finalización anticipada del análisis, para acelerar el proceso de aislamiento a mayor escala. Este péptido se aisló finalmente escalando geométricamente el gradiente focalizado más superficial.

Introducción de las muestras

No existe un eluyente o técnica universal para disolver péptidos sintéticos porque la composición y secuencia de los péptidos afectan directamente a la solubilidad. Las opciones de eluyentes útiles incluyen agua con ácido trifluoroacético al 0,1-2 %, ácido fórmico o ácido acético, dimetilsulfóxido, hexafluoroisopropanol, guanidina-HCl 6-12 M, dimetilformamida, hidróxido amónico al 0,1 % o bicarbonato amónico 10 mM. A veces, los fabricantes proporcionan una guía práctica para disolver diferentes tipos de péptidos. La disolución del péptido suele dar como resultado un volumen relativamente grande de muestra en un eluyente fuerte.

En los sistemas de cromatografía preparativa convencionales (figura 31), los grandes volúmenes de inyección de diluyentes de muestra fuertes a menudo distorsionan el cromatograma, lo que reduce la cantidad de producto que se puede aislar correctamente. A medida que aumenta la carga, se pierde la resolución de las impurezas que eluyen muy cerca. La precipitación de la muestra debido a la presencia de fase móvil acuosa en cualquier lado de la muestra en el loop o en el cabezal de la columna reduce la robustez del sistema y la vida útil de la columna.

En las separaciones convencionales, una muestra introducida en la columna en DMSO, o algún otro eluyente fuerte, comienza inmediatamente a descender por la columna, llevando consigo las moléculas de muestra (figura 32). La muestra no se retiene hasta que el eluyente fuerte se diluye en la columna. Desafortunadamente, para cuando las bandas de muestra permanecen en la columna, ya son anchas y migran unas a otras en el lecho de la columna. Cuando los componentes de la muestra se eluyen de la columna, las bandas no están diferenciadas y la pureza de cada componente es baja.

La dilución en columna (ACD), una técnica de inyección alternativa, permite la inyección de grandes volúmenes de eluyentes fuertes y al mismo tiempo mejora la solubilidad de la muestra, la carga de la columna y la resolución. Con la ACD, el sistema cromatográfico se conecta de forma que la muestra en eluyente fuerte se diluye en el cabezal de la columna con fase móvil acuosa (figura 33). La muestra se mezcla y se adsorbe muy rápidamente en la columna. La velocidad de transferencia es tan rápida que no se puede producir precipitación. El eluyente fuerte comienza a salir inmediatamente de la columna antes de que comience la elución de la muestra.

Una vez que se inicia el gradiente, los componentes de la muestra se eluyen como bandas estrechas, de bajo volumen y abruptamente resueltas (figura 34).

La mejora de la resolución entre los picos de los componentes de la muestra permite aumentar el tamaño de la muestra y, por lo tanto, reducir el número de inyecciones necesarias para el aislamiento. En la práctica, con la dilución en columna, la carga de la columna a menudo se puede aumentar de tres a cinco veces (figura 42). La robustez del sistema mejora con la dilución en columna, ya que la muestra tiene una capacidad limitada para precipitar en el loop o en el cabezal de la columna. Se reduce la incidencia de las paradas del equipo por alta presión y se prolonga la vida útil de la columna.

Ejemplo práctico de aislamiento de péptidos

Los principios de la cromatografía preparativa se aplican a todo tipo de moléculas, incluidos los péptidos. El siguiente ejemplo ilustra un flujo de trabajo típico para aislar un péptido en un entorno de investigación y aplica los factores para la optimización del método presentados con anterioridad. El procedimiento puede modificarse en función de los requisitos del proceso del laboratorio.

El péptido utilizado en este ejemplo tenía 17 aminoácidos de longitud con 3 residuos básicos, 2 ácidos, 8 no polares y 4 polares. La muestra se disolvió en dimetilsulfóxido, con agitación en vórtex y ultrasonidos, y después se pasó a través de un filtro de jeringa Acrodisc GHP de 0,45 µm. La masa monoisotópica del péptido era de 1772,9 Da y tenía los siguientes estados de carga:
[M+H]⁺ = 1773,9
[M+2H]²⁺ = 887,5
[M+3H]³⁺ = 592,2
[M+4H]⁴⁺ = 447,2

Perfil de péptido bruto

La muestra de péptido bruto se analizó con dos modificadores diferentes (0,1 % de ácido fórmico y 0,1 % de ácido trifluoroacético) en la fase móvil para determinar cuál proporcionaría la mejor separación. Aunque el acetonitrilo se utiliza con mayor frecuencia como componente orgánico de la fase móvil, en este ejemplo se utilizó isopropanol con fines ilustrativos. Los resultados se muestran en la figura 35, donde el modificador de TFA (A y B) produjo un pico del producto más definido con contaminantes bien resueltos en comparación con el ácido fórmico (C y D), todo a 40 °C. La separación también se evaluó a 25 °C y 60 °C, pero una temperatura de 40 °C mostró la mejor forma de pico y resolución de los picos de los componentes de la muestra (figura 36). La temperatura ligeramente elevada también redujo la contrapresión del sistema atribuida al isopropanol como componente orgánico de la fase móvil.

Focalizar el gradiente

Después de optimizar el modificador de la fase móvil y la temperatura para el análisis del crudo, se utilizó la focalización del gradiente para mejorar la resolución de los picos de contaminantes que eluían muy cerca. La columna de 4,6 x 50 mm tenía un volumen de 0,698 mL y el volumen del sistema se midió en 0,77 mL. El método de HPLC utilizado para el análisis de péptidos brutos se muestra a continuación:

Calcular la compensación entre el punto de formación del gradiente y el detector

Compensación = Volumen del sistema + Volumen de columna

Ejemplo:
Compensación = 0,77 mL + 0,698 mL
Compensación = 1,468 mL

Calcular el tiempo que tarda el eluyente en llegar al detector

Tiempo hasta el detector =
Compensación en mL/caudal en mL/min

Ejemplo:
Tiempo hasta el detector = 1,468 mL/1,46 mL/min
Tiempo hasta el detector = 1,00 min

Calcular el tiempo en el que se formó la concentración de elución del pico

Tiempo de concentración de elución =
Tiempo de retención del pico – Tiempo hasta el detector – Retención de gradiente

Ejemplo:
Tiempo de concentración de elución = 3,23 min – 1,00 min – 0,50 min
Tiempo de concentración de elución = 1,73 min

Calcular el % de elución del pico

% de concentración de elución =
Tiempo de concentración de elución/Longitud piloto x Cambio piloto/Segmento del gradiente +
% de gradiente piloto inicial/segmento del gradiente

Ejemplo:
% de concentración de elución = 1,73 min x 30 % + 0 %/4,78 min
% de concentración de elución = 10,85 %

NOTA: Para todos los cálculos que incluyan porcentajes, utilizar únicamente valores absolutos, es decir, 30 x 1,73 min, no 0,30 x 1,73.

Calcular la pendiente del gradiente piloto en % de cambio por volumen de columna

N.º volúmenes de columna (CV) =
1 CV x Caudal en mL x Tiempo de segmento del gradiente x mL min

Ejemplo:
N.º volúmenes de columna = 1 CV x 1,46 mL x 4,78 min/0,698 mL min
N.º volúmenes de columna = 9,99
Pendiente del gradiente piloto = % de cambio del gradiente piloto
N.º volúmenes de columna

Ejemplo:
Pendiente del gradiente piloto = 30 %/9,99 CV = 3,0 %/CV

Calcular la pendiente del gradiente focalizado en % de cambio por volumen de columna. Utilizar una quinta parte de la pendiente del gradiente piloto.

Pendiente del gradiente focalizado en %/CV =
1/5 x Pendiente del gradiente piloto

Ejemplo:
Pendiente del gradiente focalizado = 1 x 3,0 %/5 CV
Pendiente del gradiente focalizado = 0,6 %/CV


Crear segmento del gradiente focalizado desde 5 % por debajo hasta 3-5 % por encima del porcentaje de elución estimado. El pico eluyó con acetonitrilo al 10,85 %, por lo que el gradiente superficial se diseñó para que se realizara a partir de acetonitrilo al 5-13 % en 6,37 min.

Tiempo del segmento del grad. focalizado =
% de cambio x Pendiente del gradiente focalizado x Volumen de columna x Caudal en mL

Ejemplo:
Tiempo del segmento del grad. focalizado = 8 %/0,6 % x 0,698 mL/1 CV x 1 min/1,46 mL
Tiempo del segmento del grad. focalizado = 6,37 min


Escribir el gradiente focalizado comenzando en las condiciones iniciales del análisis piloto y aumentando rápidamente hasta un 5 % por debajo del % de elución del pico.

Una vez creado el gradiente focalizado, se evaluó la separación de la muestra del péptido bruto (figura 37A). Un pequeño pico de impurezas eluyó justo antes del pico del producto, pero apenas fue perceptible. Con el doble de carga (figura 37B, 72 µg), la impureza era más visible, pero el pico principal seguía siendo relativamente puro. Cuatro veces la carga original de 36 µg produjo un cromatograma en el que la impureza era más pronunciada y muy probablemente reduciría la probabilidad de obtener un producto puro si esta carga se escalara geométricamente a la columna más grande para la preparación (figura 37C). Con una carga de 256 µg en la columna analítica, la impureza coeluyó por completo con el pico principal (figura 37D).

Escalado a preparación

Se seleccionó la carga de 72 µg en la columna analítica para el escalado geométrico a la preparación. Esta carga conservadora aumentaría la probabilidad de obtener una cantidad razonable de material puro con menos inyecciones que escalando el volumen de inyección más bajo. La carga de masa es proporcional al volumen de la columna y se determina utilizando una calculadora de preparación o resolviendo M2 en la siguiente ecuación, donde:

M1 es la carga de masa en la columna 1, M2 es la carga de masa en la columna 2
L1 es la longitud y d1 es el diámetro de la columna 1, L2 es la longitud y d2 es el diámetro de la columna 2

M2 = M1 x L2/L1 x d22/d12
M2 = 72 μg x 100 mm/50 mm x 19 mm2/4,6 mm2

M2 = 72 μg x 36.100/1058
M2 = 2456 μg o 2,4 mg

Se disolvieron 44,03 mg de péptido bruto en 5 mL de DMSO y se filtraron (concentración de 8,80 mg/mL). El escalado geométrico de la carga de 72 µg en la columna analítica de 4,6 x 50 mm a la columna preparativa de 19 x 100 requirió una inyección de 2,4 mg, como se calculó anteriormente. Con una concentración de péptido bruto de 8,80 mg/mL, se calculó el volumen de inyección:

Volumen de inyección = 2,4 mg x 1 mL/8,80 mg/mL
Volumen de inyección = 0,272 mL o 272 μL

El gradiente focalizado analítico se escaló a la preparación, teniendo en cuenta los volúmenes del sistema en ambas escalas (tabla 4). Si bien el volumen muerto parecía alto para el sistema preparativo, incluía un loop de precalentamiento de 5 mL para calentar la columna, así como un loop de inyección de 2 mL. Teniendo en cuenta estas contribuciones al volumen del sistema, los 2,75 mL atribuibles al resto de los tubos del sistema eran bastante razonables. El pico del producto se recogió por tiempo (figura 38).

Tabla 4. Escalado de gradiente.

• Columna: 4,6 x 50 mm Columna: 19 x 100 mm
• Volumen muerto del sistema: 0,77 mL Volumen muerto del sistema: 9,75 mL
• Volumen de la columna: 0,698 mL Volumen de la columna: 23,804 mL
• Volumen muerto del sistema (en volúmenes de columna): 1,10 Volumen muerto del sistema (en volúmenes de columna): 0,41 Compensación del gradiente: 0,66

Análisis de fracciones

El pico del producto peptídico se recogió en dos fracciones. Estas dos fracciones eran muy puras, como se muestra en la figura 39. El pico ancho que eluyó aproximadamente a los 2,25 minutos en cada uno de los análisis de fracciones y en el blanco se debió muy probablemente a la baja concentración del modificador de ácido trifluoroacético con par iónico en la fase móvil. Los componentes hidrófobos del TFA suelen acumularse en la columna y después eluir durante el gradiente. El contaminante no procedía de ningún componente del sistema, como el inyector o las válvulas, ya que otro blanco sin la columna no mostraba picos en el cromatograma (figura 40).

Dilución en columna

Aunque el péptido se aisló con pureza alta, aumentar la carga de muestra por inyección mejoraría la eficacia del proceso y reduciría el número de análisis cromatográficos necesarios para purificar la cantidad de producto necesaria para los experimentos posteriores. Como se mencionó con anterioridad, la dilución en columna gestiona de manera muy eficaz cargas de muestra más altas con un simple cambio de las conexiones de los tubos del sistema (figura 33).

Aunque la tasa de cambio de %B por volumen de columna para el aislamiento de péptidos utilizando la dilución en columna fue la misma que el método empleado para la separación convencional con escala geométrica, la tabla de gradientes programada se modificó para incluir la contribución del eluyente orgánico introducido por la bomba auxiliar de carga de muestra (tabla 5).

Tabla 5. Comparación de gradientes: métodos convencionales y de dilución en columna.

Tiempo de gradiente: 14,40-1,66 = 12,74 min Tiempo de gradiente: 16,00-3,26 = 12,74 min
Volumen de gradiente: 12,74 min x 25 mL/min = 318,5 mL Volumen de gradiente: 12,74 min x 25 mL/min = 318,5 mL
Volúmenes de columna: 318,5 mL x 1 CV/23,804 mL = 13,38 CV Volúmenes de columna: 318,5 mL x 1 CV/23,804 mL = 13,38 CV
Pendiente de gradiente: 8 %/13,38 CV = 0,6 %/CV Pendiente de gradiente: 8 %/13,38 CV = 0,6 %/CV
Caudal de bomba de carga durante el gradiente = 1,25 mL/min
1,25 mL/min = 5 % del flujo total
Caudal de método de gradiente total = 25 mL/min

La bomba de la dilución en columna introduce eluyente orgánico directamente en el loop de muestras y está programada para funcionar al 5 % del caudal total. Por lo tanto, el caudal de la bomba cromatográfica se reduce de 25 mL/min en el método convencional a 23,75 mL/min en el método de dilución en columna. Se debe tener en cuenta que el caudal total sigue siendo de 25 mL/min (23,75 mL/min + 1,25 mL/min). Debido a que la bomba de la dilución en columna se conecta directamente al inyector, se inserta un paso de retención en la condición inicial, lo suficientemente largo como para garantizar la transferencia completa de la muestra del loop a la columna, al principio del gradiente. Este sistema está configurado con un loop de 2 mL y el paso de retención original era de 0,66 min.

Cálculo del paso de retención para el método de dilución en columna: loop de 2 mL x (1 min/1,25 mL) = 1,6 min
Paso de retención de 1,60 min + 0,66 min del método de preparación original = Paso de retención de 2,26 min para el método de dilución en la columna.

Los porcentajes de A y B del método de gradiente también se modifican para reflejar la contribución de la bomba de la dilución en columna. El gradiente focalizado comienza en el 5 %B y continúa hasta el 13 %. Debido a que la bomba de la dilución en columna suministra el 5 % del flujo total a un caudal constante de 1,25 mL/min de isopropanol, los porcentajes de B en el método de la dilución en columna se programan como 0 % y 8 %B, respectivamente. Se debe tener en cuenta que, aunque el método de dilución en columna se programa de forma ligeramente diferente, el gradiente real es idéntico al del método convencional. Debido a que este péptido eluye a un porcentaje tan bajo de B, el tiempo real empleado al 5 %B es mayor en el método de dilución en columna, al incorporar el tiempo empleado en el cambio de 0 %B al 5 %B en el método de preparación convencional del tiempo de retención en el método de dilución en columna. Estos dos pasos se programan en tubos independientes en el método de dilución en columna para que sea más claro para el lector. Debido a que los porcentajes de B disminuyen para representar el 5 %B suministrado por la bomba de la dilución en columna, los porcentajes de A deben aumentarse en un 5 % para mantener el gradiente idéntico al del método de inyección convencional original. Si el sistema cromatográfico presenta pasos de lavado en la secuencia de inyección, cabe asegurarse de que todos los tubos de lavado estén cebados y llenos de eluyente de lavado fuerte.

Debido a que el aislamiento a gran escala con escala geométrica se realizó a 40 °C, la temperatura se mantuvo para la inyección utilizando la dilución en columna. El loop de precalentamiento del eluyente se insertó justo antes de la T en el flujo de eluyente acuoso (figura 41).

A continuación, se sumergieron en el baño de agua el loop de precalentamiento del eluyente, la T y la columna. Antes de iniciar la separación por gradiente, se dejó que la presión se estabilizara, lo que implicaba que se había alcanzado el equilibrio del sistema. Si bien 2,4 mg de péptido era la cantidad máxima de muestra que se podía inyectar con la configuración de conexión de tubos convencional, se introdujo cinco veces esa cantidad, o 12 mg (1,36 mL), en la columna con el sistema en la configuración de dilución en columna (figuras 42 y 43). Las fracciones se recogieron por tiempo y posteriormente se analizaron utilizando el método de screening original al 0-30 %B. Las fracciones mostraban una pureza excelente y eran comparables con las fracciones recogidas de la preparación que utilizó la técnica de inyección convencional (figura 44).

Consideraciones especiales para péptidos hidrófobos

Se disolvió en dimetilsulfóxido un péptido hidrófobo compuesto por 12 residuos de aminoácidos no polares y 3 polares. El gradiente focalizado preparativo que se muestra a continuación se utilizó para el aislamiento en una columna de 19 x 100 mm con el sistema cromatográfico conectado para la inyección convencional. La hidrofobia extrema del péptido requería el uso de un caudal reducido, una carga de muestra más baja y una temperatura de 60 °C.

Aunque este péptido es un buen candidato para usar la dilución en columna, aumentar la carga de masa en la columna supone un riesgo de precipitación. Debido a que el péptido eluye a aproximadamente un 50 % de acetonitrilo, cargar esta muestra a un 5 %B (como en el ejemplo anterior) está tan por debajo de la fuerza de elución requerida que el péptido es propenso a la precipitación a medida que se diluye en el cabezal de la columna. Aumentar el porcentaje de eluyente orgánico procedente de la bomba cromatográfica durante el paso de carga alivia el posible problema de precipitación. En general, para compuestos extremadamente hidrófobos, el uso de un porcentaje inicial de eluyente orgánico en el método de gradiente que sea un 20-25 % por debajo del porcentaje de elución del compuesto esperado evita la precipitación de la muestra, al tiempo que se conservan las ventajas de la técnica de dilución en columna. El gradiente de dilución en columna modificado que se muestra a continuación se utilizó para cargar una muestra cinco veces más grande en la columna de 19 x 100 mm (figura 45).

El gradiente comenzó con un 48 %B (43,6 %B + 5 %B de la bomba de dilución en columna) y finalizó con un 53 % de acetonitrilo en 29 minutos con una pendiente del 0,49 % de cambio por volumen de columna, idéntica a la velocidad de cambio del gradiente utilizada para la inyección convencional. La bomba de la dilución en columna transportó la muestra de péptido desde el loop de 5 mL hasta la T en acetonitrilo al 100 %, donde se encontró con la fase móvil de la bomba cromatográfica en su condición inicial, 23,6 %B (18,6 %B + 5 %B de la bomba de dilución en columna). La retención de 9,2 minutos al principio del método garantizaba que la muestra se cargara por completo en la columna. La bomba de la dilución en columna funcionó a un caudal constante de 0,8 mL/min, que era el 5 % del caudal total de 16,3 mL/min.

Todas las columnas deben limpiarse ocasionalmente, tanto si se utilizan para separaciones de moléculas pequeñas como grandes. La alta contrapresión, el alto fondo cromatográfico y los picos extraños que no pueden atribuirse a la muestra son indicios de que la columna necesita una limpieza.

Evitar la acumulación de contaminantes en la columna es la mejor manera de prolongar su vida útil. Se recomienda filtrar todas las muestras antes de la inyección. Agregar un filtro en línea o una precolumna antes de la columna ayuda a atrapar las partículas y otros componentes no deseados de la mezcla. Lavar la columna con dos o tres volúmenes de columna de un alto porcentaje de eluyente orgánico después de cada separación es útil para eliminar sistemáticamente los contaminantes no deseados. Por último, la dilución en columna mantiene las muestras en la solución, lo que evita las paradas del equipo por alta presión y hace pasar eficazmente los componentes de la muestra a través del sistema de purificación, tanto si su destino final es un tubo de recogida de fracciones como un recipiente de desechos.

La contrapresión alta que se produce repentinamente se debe probablemente a la precipitación de la muestra en algún lugar del sistema: en el loop de muestra, los tubos, la columna o la cubeta de flujo del detector. Con el bombeo del sistema cromatográfico, aflojar metódicamente los conectores para sistemas HPLC empezando por el conducto de desechos y pasando por las bombas aislará definitivamente la fuente de la alta presión. Un aumento gradual de la contrapresión es probablemente el resultado de la acumulación de impurezas en la columna después de varias inyecciones y puede corregirse de varias maneras. Se pueden utilizar gradientes rápidos repetitivos a temperatura elevada, lavar la columna durante un tiempo prolongado en un alto porcentaje de eluyente orgánico o inyectar un “eluyente de limpieza” como DMSO o ácido fórmico al 1-10 % para eliminar los contaminantes no deseados de la columna (figura 46).

La despirogenización, la eliminación de polisacáridos endotóxicos de la columna que podrían contaminar el producto final e inducir una reacción alérgica, normalmente requiere un lavado fuerte con hidróxido de sodio 1 M durante una hora o más. Este procedimiento es incompatible con las columnas actuales.