Enfoques prácticos para el aislamiento de péptidos

Los péptidos desempeñan un papel único en el desarrollo de nuevos fármacos candidatos y llenan un nicho especializado entre los tratamientos tradicionales de moléculas pequeñas y los fármacos con proteínas más grandes. Con mayor eficacia, seguridad y tolerabilidad en humanos en comparación con moléculas pequeñas, y con menor complejidad y coste de producción que los productos biofarmacéuticos basados en proteínas, los péptidos son cada vez más atractivos como posibles fármacos candidatos para muchas enfermedades. Los péptidos sintéticos pueden utilizarse para estudiar las relaciones de estructura-actividad entre sustratos celulares o ser eficaces como fármacos en sí mismos. Tanto si los péptidos se producen paso a paso utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida, la síntesis en fase de solución como si aíslan de fuentes naturales, casi todas las mezclas de péptidos brutos son complejas y requieren purificación. Aunque las reacciones de síntesis se controlen cuidadosamente, es inevitable que se formen impurezas que pueden incluir eliminaciones, truncamientos o secuencias modificadas químicamente, incluidos aductos de escisión u otros subproductos formados durante el procesamiento.

Los avances tecnológicos en la metodología analítica realizados en los últimos años también han influido en la prevalencia de los péptidos en diagnósticos y terapias emergentes. Los métodos analíticos ejecutados con instrumentos de última generación muestran una mejora de la sensibilidad y una mayor resolución en un tiempo más corto, lo que conlleva un ahorro de tiempo crítico durante la producción.

Los péptidos sintéticos presentan desafíos únicos en el desarrollo de un método de aislamiento. Para estudios futuros, la pureza y el rendimiento de péptidos objetivo son factores críticos que influyen en los resultados experimentales. Como se mencionó con anterioridad, el número de impurezas resultantes de la síntesis, escisión y desprotección de un péptido sintético puede ser bastante grande. El aislamiento del producto peptídico se puede mejorar aplicando los principios del desarrollo de métodos que a menudo se asocian con la HPLC analítica. Los mecanismos de separación utilizados para crear un método de purificación en la escala preparativa más grande son los mismos que los principios que se utilizan en la escala más pequeña. La selección de la columna, la elección del modificador de fase móvil, el uso de la temperatura y la optimización del gradiente son opciones que deben examinarse en el desarrollo de cualquier método de separación. El desarrollo sistemático de métodos para el aislamiento de péptidos puede mejorar significativamente la pureza y el rendimiento del producto. Aunque el aislamiento tradicional de péptidos se realiza habitualmente mediante cromatografía dirigida por UV, el aislamiento dirigido por masas junto con el desarrollo de métodos prudentes facilita el proceso de purificación al mejorar la discriminación entre el péptido objetivo y los contaminantes formados durante la síntesis y la escisión.

Los sistemas de cromatografía líquida más simples configurados con una bomba, un inyector, un detector UV y un colector de fracciones son perfectamente adecuados para el aislamiento de péptidos (figura 3). La detección de masas, aunque no es necesaria para el aislamiento de péptidos, identifica el péptido objetivo y reduce el número de fracciones recogidas que requieren análisis después del aislamiento. Los compuestos que no se ionizan, o que se ionizan de manera defectuosa, a menudo se detectarán con UV de longitud de onda baja. Por el contrario, los péptidos con una extinción de UV muy baja suelen detectarse fácilmente con MS.

Modos de separación

Debido a que las propiedades de los diferentes péptidos son tan diversas, los modos cromatográficos de separación también varían. Si bien la cromatografía en fase reversa es, con mucho, el modo más popular para purificar péptidos, algunos péptidos se aíslan de manera más eficiente utilizando una selectividad alternativa, como el intercambio iónico o la exclusión por tamaño. Estas técnicas alternativas también se pueden combinar con la fase reversa, creando un proceso de dos pasos para muestras difíciles.

Fase inversa

Debido a su reproducibilidad y amplia aplicabilidad, la cromatografía en fase reversa se utiliza habitualmente para la separación de muchos tipos de compuestos, incluidos los péptidos. La sílice unida a C₁₈, uno de los tipos más populares de material de relleno de columnas en fase reversa, es no polar. Las fases móviles en fase reversa, generalmente compuestas por agua con un eluyente orgánico polar miscible, como acetonitrilo o metanol, eluyen los compuestos de las columnas C₁₈ en función de su polaridad. Por lo tanto, cuanto más hidrófobo sea un péptido, más retendrá en una columna C₁₈.

Aunque el C₁₈ es el material de relleno en fase reversa más utilizado, también se pueden unir otros ligandos (C₄, C₈, RP18, fenilo y otros) a la partícula base para proporcionar una selectividad alternativa para la separación optimizada de compuestos. Si bien la sílice fue uno de los primeros sustratos que se utilizaron para los materiales de relleno en fase reversa, los materiales de relleno con base de sílice imponen límites en la velocidad de separación, la resolución, el pH, la temperatura y la capacidad de carga de la columna. La tecnología de partículas híbridas patentada*, utilizada en el desarrollo de nuevos sustratos de columna, crea partículas que pueden funcionar a velocidades, temperaturas y pH más altos, a la vez que mejora la selectividad, la resolución, la reproducibilidad y la vida útil de la columna.
*Patente en EE. UU. n.º 6,686,035 B2

Intercambio iónico

La cromatografía de intercambio iónico se ha utilizado durante mucho tiempo para el aislamiento de proteínas y otros compuestos biológicos. Debido a que los aminoácidos de un péptido pueden tener carga positiva o negativa, se puede utilizar la cromatografía de intercambio iónico para el aislamiento de péptidos. Las resinas poliméricas naturales funcionalizadas, como la agarosa, los polímeros sintéticos como el poli(metilmetacrilato) (MMA) o el poliestireno divinilbenceno, se utilizan comúnmente para separaciones de moléculas grandes, ya que estos materiales pueden soportar los estrictos requisitos de limpieza que deben aplicarse entre los ciclos de procesamiento y los lotes en bioprocesamiento a gran escala. Las soluciones de hidróxido de sodio utilizadas en estos procesos son perjudiciales para los materiales con base de sílice comúnmente utilizados para aislamientos de moléculas pequeñas y péptidos a pequeña escala.

Hay cuatro tipos de intercambiadores iónicos: aniónico débil, catiónico débil, aniónico fuerte y catiónico fuerte. El intercambio catiónico se utiliza para retener y separar los iones cargados positivamente en una superficie negativa, mientras que el intercambio aniónico se utiliza para retener y separar los iones cargados negativamente en una superficie positiva. Las columnas de intercambio aniónico y catiónico fuerte se ionizan por completo en un amplio intervalo de pH (2-12), mientras que las columnas de intercambio iónico débil se cargan en un intervalo de pH estrecho (de 9,5 a 5,5).

El aislamiento de péptidos mediante intercambio catiónico es más común que el intercambio aniónico, pero el modo preferido realmente depende de la secuencia del péptido. Para las separaciones de péptidos realizadas a un pH inferior a 3, las cargas negativas de los grupos carboxilo de las cadenas laterales de aminoácidos se neutralizan y los grupos N-terminales se protonan, lo que hace que los péptidos se carguen positivamente y se atraigan a los sitios negativos de la columna de intercambio catiónico (figura 4).

Por el contrario, para aquellos péptidos más adecuados para la separación a un pH entre 6 y 10, se puede utilizar el intercambio aniónico. Con el intercambio aniónico a un pH más alto, los grupos carboxílicos del péptido se cargan negativamente y se atraen a los sitios positivos de la columna de intercambio aniónico (figura 5).

Se pueden ofrecer algunas sugerencias generales para seleccionar una columna y desarrollar un método para el aislamiento de péptidos mediante intercambio iónico. Se puede utilizar intercambio aniónico o catiónico. Como punto de partida general, los péptidos ácidos se separan en el intercambio aniónico y los péptidos básicos en el intercambio catiónico. Esta selección puede invertirse provechosamente para algunos péptidos, en particular los más grandes, pero el pH debe ajustarse para que la carga neta sea la opuesta al material de relleno.

Para cualquier polaridad, se prefieren los intercambiadores fuertes para la cromatografía de péptidos. La carga de un péptido es una función de la secuencia y del microambiente alrededor de las cadenas laterales cargadas. Se pueden utilizar pequeños ajustes en el pH de la fase móvil para ajustar la selectividad de la separación en función de la secuencia de péptidos específica. Estos pequeños ajustes de selectividad no afectan a la capacidad de unión del intercambiador iónico fuerte.

La selección de la fase móvil y las condiciones de funcionamiento dependen de si se prevé que la separación por intercambio iónico sea el primer paso de una purificación en dos pasos o que sea el único paso de aislamiento que produzca el material experimental. Si el material recogido del intercambio iónico debe purificarse más con la fase reversa, los tampones y las condiciones de elución pueden seguir las prácticas habituales para el intercambio iónico de proteínas; por ejemplo, utilizando tampones de fosfato o Tris y eluyendo con un gradiente de cloruro de sodio. Las sales se eliminarán del producto en el paso siguiente.

Si se elige el intercambio iónico para producir péptidos utilizables en un solo paso, es prudente elegir soluciones tampón volátiles que se puedan eliminar por liofilización. El formiato amónico es una buena primera opción, ya que tiene dos regiones tampón que corresponden a los valores de pK del amonio y el formiato. Se puede utilizar a un pH entre 3 y 4 para la cromatografía de intercambio catiónico de péptidos básicos o a un pH entre 9,25 y 10,25 para la cromatografía de intercambio aniónico de péptidos ácidos. La elución se puede llevar a cabo con un gradiente de fuerza iónica de concentración creciente de formiato amónico a pH constante. Alternativamente, la elución con un gradiente de pH reduce la liofilización lenta de las soluciones tampón de alta fuerza iónica. Una vez más, las soluciones tampón de formiato amónico proporcionan un punto de partida útil. La elución procede de un pH alto a uno bajo para los péptidos ácidos en intercambiadores de aniones, y de un pH bajo a uno alto para los péptidos básicos en intercambiadores de cationes.

Exclusión por tamaño

La separación cromatográfica de moléculas basada en el tamaño, llamada hoy cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), se remonta a la década de 1950. La separación de moléculas basada en el tamaño, más que en sus propiedades químicas como la carga o la polaridad, también se ha conocido históricamente como filtración en gel o cromatografía de permeación en gel (GPC). Las partículas de la fase estacionaria con una distribución de tamaño de poro definida excluyen las moléculas de muestra que son más grandes que las cavidades en el lecho de la columna, lo que hace que se eluyan muy rápidamente, mientras que las moléculas pequeñas entran en los poros y, posteriormente, recorren un camino más tortuoso y más lento hacia la elución. Por lo tanto, las moléculas grandes se eluyen primero, mientras que las moléculas más pequeñas se eluyen en orden decreciente de tamaño en la solución (figura 6). La SEC es una técnica de baja resolución que utiliza métodos isocráticos y no requiere equilibrado entre análisis. La carga de la columna depende del volumen y la concentración de la muestra, y ambos factores afectan a la resolución.

La SEC se utiliza a veces como un paso de limpieza inicial para eliminar secuencias truncadas, péptidos con desprotecciones incompletas y otras impurezas. A medida que aumenta la longitud de un péptido sintético, el número de estos contaminantes puede ser significativo. Cualquier simple paso de purificación inicial antes del aislamiento mediante fase reversa reduce la complejidad cromatográfica. La SEC también se puede utilizar para el intercambio de soluciones tampón, es decir, cambiar la solución tampón desde la que actualmente se disuelve el péptido a otra solución tampón o solución que sea más adecuada para el siguiente experimento o paso de purificación.

Resumen

Los péptidos se pueden analizar y aislar utilizando muchas técnicas cromatográficas diferentes, incluida la fase reversa, el intercambio iónico y la exclusión por tamaño. La metodología empleada en la escala semipreparativa (de unos pocos miligramos a unos cientos de miligramos para el aislamiento) suele ser la fase reversa. El resto de esta sección sobre el aislamiento de péptidos se dedicará a los factores y técnicas que se pueden utilizar para optimizar el análisis y la purificación de péptidos mediante cromatografía en fase reversa.