Química básica de GPC

Introducción a la separación por tamaño

La cromatografía de permeación en gel (GPC), también conocida como cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), es realmente la más fácil de comprender de todas las técnicas de cromatografía líquida. La separación se basa estrictamente en el tamaño de la muestra en solución y no debe haber interacción con el relleno de la columna (adsorción, partición, etc.), como ocurre con la HPLC convencional. El modo de separación no se basa en el peso molecular, sino en el tamaño del material que se analiza (generalmente un polímero) en solución. Es decir, para realizar la GPC correctamente, la muestra debe estar disuelta en un eluyente adecuado.

La concentración de la muestra en solución depende del peso molecular, pero es típica una concentración del 0,10 % (p/v) para un polímero de peso molecular de ~100 000. (Para obtener más información, consultar la sección Preparación de la muestra, a continuación). A veces, la solución de muestra se debe calentar para disolver la muestra. Por ejemplo, algunas poliolefinas necesitan temperaturas superiores a 120 ºC para disolverse y, por lo general, se analizan en 1,2,4 triclorobenceno a 140 ºC.

Una vez que la muestra se ha disuelto adecuadamente, se introduce mediante un mecanismo de inyección en un conjunto de columnas que actúan como sistema de filtración molecular. Las columnas se rellenan con un gel reticulado (por ejemplo, copolímero de estireno/divinilbenceno para aplicaciones orgánicas) que contiene poros en la superficie. Estos poros pueden variar de pequeños a bastante grandes y actúan como los filtros moleculares mencionados anteriormente. Las moléculas de mayor tamaño no encajarán en los poros más pequeños. Por el contrario, las moléculas más pequeñas encajarán en la mayoría de los poros y serán retenidas por más tiempo.

Una de las primeras demostraciones de GPC realizadas por Waters hace décadas fue en la goma de mascar. La goma de mascar es realmente goma sintética, más aditivos como aromatizantes, estabilizadores, etc.

Aquí hay una representación del cromatograma de GPC original separado en varias columnas de varios tamaños de poro conectadas en serie. El polímero (caucho en este caso) se eluye primero porque es la molécula más grande, seguido de los "aditivos" en orden decreciente de tamaño. También podría ser un cromatograma de PVC con una mezcla de plastificantes, antioxidantes y estabilizadores UV.

Monómeros, oligómeros, polímeros y distribuciones de peso molecular

Los monómeros tienen un solo peso molecular y se dice que son monodispersos. Por ejemplo, etileno, estireno, cloruro de vinilo, etc. Después de los monómeros están los dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, etc., los cuales se denominan oligómeros. Cuando llegamos a pesos moleculares más altos, el grupo pasa a denominarse polímeros. Los polímeros tienen una distribución de longitudes de cadena y, por lo tanto, pesos moleculares. Dependiendo de cómo se haya realizado la polimerización, esta distribución puede ser estrecha o bastante amplia. Por ejemplo, un polímero de condensación o de crecimiento por etapas, como un poliéster (polietilentereftalato), tendrá una distribución bastante estrecha de pesos moleculares. Por otro lado, una polimerización por radicales libres puede producir un polímero con una distribución muy amplia de longitudes de cadena y pesos moleculares (por ejemplo, para las poliolefinas). Controlar la cinética de la polimerización es extremadamente importante para obtener la distribución deseada del peso molecular. Por eso, la GPC es una técnica tan importante para el químico de polímeros.

Aquí mostramos una superposición de dos distribuciones de peso molecular de un polímero (en este caso poliestireno):

Una vez que se obtiene la distribución del peso molecular de la muestra de polímero, es necesario encontrar una forma de cuantificarlo. Se asignan los promedios de los pesos moleculares a través de esta distribución simplemente realizando estadísticas. A cada corte, se le atribuye una altura, (Hi, también representada como concentración, Ci), un tiempo de retención y un peso molecular, (Mi). El peso molecular se obtiene a partir de una curva de calibración (consultar la siguiente sección). A continuación, se realiza una suma para obtener los diversos promedios de los pesos moleculares que describen la distribución del peso molecular del polímero. La PD que se muestra es la relación entre el promedio en peso y los pesos moleculares promedio en número y se denomina polidispersidad o, a veces, simplemente, dispersidad del polímero. Esta suma es solo una manera sencilla de obtener estos cuatro momentos estadísticos del peso molecular y describir la distribución del peso molecular.

Existen otras técnicas para obtener estos promedios de peso molecular:

• El promedio en número, Mn, se puede obtener por osmometría de membrana o análisis de grupos terminales (titulación, RMN, etc.)
• El promedio en peso, Mw, se puede obtener por dispersión de la luz
• El promedio Z, Mz y el promedio Z + 1, Mz + 1, se pueden obtener por ultracentrifugación

Una vez calibrado nuestro sistema de GPC, podemos obtener todos estos promedios con una sola inyección.

Configurar un sistema de GPC

Una vez que se tiene conocimiento acerca de qué significan los diferentes tipos de peso molecular, es momento de configurar un sistema.

El sistema (que se mostró anteriormente) consta de una bomba, un inyector de tipo manual o automatizado, el conjunto de columnas, el detector o detectores y algún tipo de dispositivo de gestión de datos. Además, es recomendable usar un desgasificador, especialmente cuando se utiliza THF con un detector de índice de refracción. Las columnas casi siempre se calientan a una temperatura elevada, incluso para aplicaciones solubles a temperatura ambiente, a fin de asegurar una caída de presión baja y viscosidades uniformes. Ahora, es momento de analizar el sistema con más detalle.

Administración de eluyentes

Las bombas que se utilizan actualmente con los sistemas de GPC de Waters son dispositivos de manipulación de fluidos realmente sofisticados. En el caso del sistema de fluidos que se utiliza en el sistema Alliance, se trata en realidad de un sistema de gestión de eluyentes. Lo más importante a tener en cuenta al elegir un módulo de fluidos para el análisis por GPC es la precisión del flujo. La calibración del sistema es un gráfico del tiempo de retención (o volumen) frente al logaritmo del peso molecular. Cualquier fluctuación menor del flujo dará lugar a un error potencialmente mayor en el peso molecular. Es ventajoso utilizar el dispositivo de manipulación de fluidos más preciso posible. Esto mejorará enormemente la precisión de las mediciones del promedio de peso molecular en comparación con algunas de las bombas tradicionales de precisión de bajo flujo que aún se utilizan. Con el sistema de gestión de eluyentes que se utiliza con el sistema Alliance, la precisión del flujo es notablemente inferior al 0.075% sin ninguna corrección del flujo. Algunas bombas del mercado afirman tener una precisión de flujo similar, pero con la corrección del flujo por software. Se debe tener cuidado con las bombas del mercado con una especificación del 0,3 % (o peor) al configurar un sistema de GPC.

El sistema Alliance de gestión de eluyentes también proporciona un rendimiento excepcional en el programa de flujo y gradiente. Muchos de los químicos que caracterizan polímeros se están dando cuenta de la importancia que tiene analizar los paquetes de aditivos, además de determinar la distribución del peso molecular del polímero. En muchos casos, el paquete de aditivos tiene tanto que ver con la aplicación exitosa de un producto terminado como el polímero utilizado para fabricar el producto. Cualquier error en la combinación (por ejemplo, de un antioxidante incorrecto o un nivel incorrecto de plastificante) de los aditivos en la fórmula principal puede dar lugar a propiedades físicas y rendimiento inaceptables. Para caracterizar con éxito el paquete de aditivos, se realiza un análisis por HPLC en gradiente de fase inversa. Además de los aditivos para polímeros, las resinas epoxi y fenólicas se analizan regularmente tanto por GPC (para examinar la distribución de oligómeros) como por HPLC en gradiente (para caracterizar el isómero y las impurezas). El sistema Alliance permite realizar tanto un análisis por GPC de alto rendimiento como un análisis en gradiente con un solo sistema.

Gestión de muestras

El siguiente paso en la configuración de nuestro sistema es decidir cómo introducir los patrones y las muestras para la separación. La manera menos costosa de hacerlo es con un inyector manual. Se llena manualmente un bucle (volumen conocido) y se abre una válvula para dejar que la solución fluya hacia la columna configurada con el flujo del eluyente. Esto está bien cuando se analizan solo algunas muestras de vez en cuando. Sin embargo, si se analizan varias muestras todos los días, puede ser mejor considerar un inyector automático.

El inyector automático más utilizado en la actualidad para el análisis por GPC a temperatura ambiente es el 2707 Autosampler. Este inyector automático totalmente eléctrico permite configurar una bandeja llena de muestras para que se analicen sin supervisión durante el tiempo que dura el análisis. La exactitud y reproducibilidad del volumen de inyección es insuperable, lo cual es fundamental para las mediciones de masa del detector sensible al peso molecular (por ejemplo, con un viscosímetro o un detector de dispersión de la luz) en las que se debe conocer la carga de masa exacta. Otra opción para un inyector automático es el sistema Alliance. Hay cinco carruseles diferentes, cada uno con capacidad para 24 muestras (capacidad total de 120 muestras).

Selección de columnas

Una vez que se haya encontrado un eluyente adecuado para disolver el polímero y preparado los patrones estrechos y las muestras a la concentración correcta, se inicia el análisis. Cuando se haya elegido el conjunto de columnas correcto para hacer el análisis, ya se puede comenzar. Sin embargo, es necesario revisar el procedimiento para elegir el conjunto de columnas correcto.

A muchas personas les gusta usar lo que solían llamarse columnas "lineales", que también se denominan columnas de "rango extendido" o "lecho mixto". Estas columnas son mezclas de diferentes tamaños de poros, con la idea de cubrir un intervalo de pesos moleculares más amplio que una columna con un solo tamaño de poro. Si la mezcla de los poros se realiza con el suficiente cuidado, la curva de calibración de la columna puede ser lineal.

El inconveniente de usar estas columnas de lecho mixto es que se obtendrá menos resolución en un rango molecular finito que si se usaran las columnas de tamaño de poro individual. Por ejemplo, en caso de utilizar una serie de resinas epoxi o fenólicas, por ejemplo, con un intervalo de peso molecular de unos cientos a cinco mil, ¿qué conjunto de columnas se utilizaría? La primera consideración es tener suficiente volumen de poros en el conjunto de columnas para obtener la separación correcta, es decir, el perfil de distribución correcto del polímero. Una columna ciertamente no es suficiente, y dos aún pueden no ser suficientes. Se deben usar al menos tres columnas en serie para garantizar el volumen suficiente de poros a fin de obtener una separación exitosa.

Ahora bien, ¿qué columnas se utilizarán para analizar la resina epoxi o fenólica? ¿Se debería utilizar un conjunto de columnas de "lecho mixto" con una mezcla de tamaños de poro? ¿O se debería utilizar una serie de columnas de tamaño de poro individual para apuntar realmente al intervalo de pesos moleculares de interés? La siguiente tabla indica el intervalo de pesos moleculares de separación para columnas de tamaño de poro individual de los empaquetados de estireno/divinilbenceno, en función de los límites de exclusión de la longitud de la cadena de poliestireno (en ángstroms):

Solo unas palabras más sobre las columnas. Si se consulta la guía de eluyentes para GPC, se podrá observar un intervalo de temperaturas de funcionamiento típico. En el análisis por GPC, casi siempre se calientan las columnas a una temperatura elevada, como se muestra en la guía de eluyentes (incluso para las aplicaciones a temperatura ambiente). El propósito de calentar las columnas no es para fines de disolución, sino para aumentar la resolución de la separación, mejorar el proceso de permeación y, en algunos casos, disminuir la viscosidad del eluyente (DMF, por ejemplo) y reducir la contrapresión en la batería de columnas. 

Opciones de detectores

El detector más utilizado en la actualidad para el análisis por GPC es el refractómetro diferencial. Es un detector sensible a la concentración que simplemente mide la diferencia en el índice de refracción (dRI) entre el eluyente en el lado de la referencia y la muestra + eluyente en el lado de la muestra. Es un detector "universal" (a diferencia de un detector UV, por ejemplo) en el que se obtendrá una respuesta para cualquier polímero que tenga una diferencia significativa en el índice de refracción en comparación con el eluyente. En algunos casos, el dRI de la muestra y el eluyente (siliconas y THF, por ejemplo) es muy pequeño, lo que produce una señal deficiente. En ese caso, es necesario encontrar otro eluyente que disuelva el polímero y proporcione un dRI significativo. El refractómetro 2414 de Waters (y los modelos 2410 y 410 anteriores) ha sido el estándar en la industria durante muchos años.

Otro detector que se utiliza con frecuencia para GPC es el detector UV. Obviamente, es necesario que haya algún cromóforo presente que absorba los rayos UV para obtener una señal. El detector UV es excelente para polímeros de tipo estirénico (poliestireno, estireno/isopreno, estireno/butadieno, ABS, etc.), epoxis, fenólicos, policarbonatos, poliuretanos y poliésteres aromáticos, por ejemplo. Cuando se realiza un análisis en gradiente (la composición del eluyente se ha modificado a lo largo del análisis) se debe utilizar el detector UV, ya que el detector RI continuaría presentando deriva a medida que cambia la composición del eluyente. El detector UV 2489 de Waters proporciona una excelente sensibilidad, linealidad y un rendimiento excepcional en general para el análisis por GPC/HPLC de polímeros y aditivos que absorben la luz UV.  

También es posible utilizar un detector de matriz de fotodiodos (PDA), el cual está un paso por encima del UV, y es un detector potente y rico en información. En este detector se utiliza una matriz de fotodiodos, donde es posible observar una amplia variedad de longitudes de onda instantáneamente. Por ejemplo, se puede configurar el PDA para que se focalice en un intervalo de longitudes de onda de 190 a 800 nanómetros (nm), en lugar de focalizarse en solo una o dos longitudes de onda como la mayoría de los detectores UV. Ahora es posible observar los espectros UV reales de la muestra del polímero (o de los aditivos). Esto permite determinar información sobre la distribución de la composición química. Se puede determinar si un SBR (caucho de estireno/butadieno) es un copolímero en bloque o aleatorio, por ejemplo. Es posible crear bibliotecas de espectros con las que comparar las muestras desconocidas del usuario. Esto se puede hacer con polímeros o aditivos de los polímeros. Ahora es posible identificar qué aditivos están presentes en los materiales compuestos acabados. El PDA también se puede utilizar para averiguar la formulación de compuestos de la competencia.  

A medida que los químicos que caracterizan los polímeros se esfuerzan por aprender todo lo posible sobre las muestras, se consideran otras opciones de detección. A medida que nos adentramos en el mundo de la detección "avanzada" para el análisis por GPC, comenzamos a considerar los detectores sensibles al peso molecular, como la viscosimetría y la dispersión de la luz. El detector de viscosímetro se analizará con cierto detalle en la siguiente sección de calibración. Esencialmente, poner un detector de viscosímetro en línea con el refractómetro es una manera de obtener no solo la viscosidad intrínseca [h] del polímero, sino también el peso molecular "absoluto" y la estimación de la ramificación de cadena larga. El detector RI es el detector de concentración (C) y el viscosímetro proporciona [h](C). El uso de las dos señales en conjunto proporciona la viscosidad intrínseca en cada corte a través del perfil de elución del polímero. A continuación, se pueden utilizar los conceptos de calibración universal de Benoit que se describen en la siguiente sección para obtener el peso molecular absoluto de la muestra de polímero.  

El detector de dispersión de la luz, junto con el refractómetro, es otro modo consistente de detección avanzada para el análisis por GPC. Básicamente, se enfoca un rayo láser en una celda (en línea en este caso) que contiene la solución de muestra. El haz incidente será dispersado por las partículas de polímero que están en la solución. Dependiendo del diseño del detector de dispersión de la luz (ángulo pequeño o multiángulo), el peso molecular promedio en peso, Mw, se puede medir con precisión con o sin el resultado del radio de giro del polímero en la solución.  

Tanto en el caso del viscosímetro como del detector de dispersión de la luz junto con el RI, se obtiene mucha información muy útil. El uso de un enfoque de triple detector proporciona datos muy significativos, siempre que el usuario sea capaz de interpretarlos todos. Para obtener información más detallada sobre la reducción de los datos de varios detectores, consultar la sección de referencias.  

Existen otras técnicas para la detección avanzada de polímeros y aditivos, como la espectrometría de masas, pero los detectores habituales que se utilizan actualmente para el análisis por GPC son los siguientes: RI, UV/PDA, viscosímetro y dispersión de la luz.

Tratamiento de datos

Una vez configurada la parte principal del hardware de nuestro sistema, es necesario considerar las opciones de software para el control de este sistema y el tratamiento de los datos. Los cálculos de calibración y distribución de los pesos moleculares se pueden realizar en segundos con las formidables computadoras modernas. El software Empower se puede utilizar tanto para la reducción de datos de la GPC convencional (solo RI) como para detección por RI/viscosimetría. Empower 2 admite muchos procedimientos de calibración, incluida la calibración relativa, la correspondencia acumulativa y la calibración de patrones amplios de Hamielec, y la calibración universal. Se admiten los ajustes de curva de cero a quinto orden, junto con una calibración asociada tipo Bounded y un ajuste de interpolación tipo spline.