Guía para principiantes sobre cromatografía de exclusión por tamaño

¿Qué columnas se deben utilizar y por qué?

La selección de la columna es fundamental para garantizar que se obtenga la distribución correcta del peso molecular del polímero de interés.

Factores iniciales a considerar: Solubilidad

Soluble en agua:

• Línea de columnas Ultrahydrogel

Orgánico soluble:

• Styragel HR para trabajos de alta resolución
• Styragel HT para trabajos a alta temperatura
• Styragel HMW para polímeros de peso molecular ultraalto

¿Con qué eluyente se deben comprar las columnas empaquetadas y por qué?

Las columnas HR, HT y HMW se empaquetan en:

• THF
• Tolueno
• DMF

Hay disponibles columnas especiales empaquetadas en metanol específicamente para análisis a temperatura ambiente con HFIP (hexafluoroisopropanol). En caso de utilizar un eluyente diferente a los cuatro mencionados para una aplicación, hay un par de reglas generales a tener en cuenta. En caso de llevar a cabo una aplicación a "temperatura ambiente" en un eluyente como cloroformo o diclorometano, efectuar la conversión a partir de THF. En caso de tener prevista la realización de un trabajo a alta temperatura en TCB, ODCB, por ejemplo, efectuar la conversión a partir de tolueno a ~85-90 ºC. En caso de utilizar un eluyente muy polar, como DMAc (dimetilacetamida) o NMP (n-metilpirrolidona), efectuar la conversión a partir de DMF.

¿Y si tengo columnas en eluyente “A” y quiero cambiar al eluyente “B”?

Por lo general, se puede cambiar directamente de un eluyente a otro a una velocidad de 0,1 a 0,2 mL/minuto (consultar el manual de uso y cuidado de la columna) si los dos eluyentes son miscibles. Si los eluyentes no son miscibles, se deberá utilizar un eluyente intermedio (en el que ambos sean miscibles).

¿En qué orden se deben colocar las columnas y por qué?

Por lo general, no importa en qué orden se coloquen las columnas. El orden no afectará a los cálculos de distribución de peso molecular del polímero eluyente. Sin embargo, es recomendable colocar siempre las columnas de 100 Å o 50 Å al final del conjunto, ya que el gel de estireno/divinilbenceno de dichas columnas tiende a ser más suave y menos duradero.

¿Qué flujo se debería utilizar en la columna de GPC?

Se recomienda no exceder 1,0 mL/min para las columnas analíticas con un diámetro interno de 7,8 mm. La resolución "óptima" para estas columnas es aproximadamente de 0,70 a 0,80 mL/min. El flujo óptimo para las columnas de calibre estrecho con un diámetro interno de 4,6 mm es de 0,3 a 0,35 mL/min. Para obtener más información, consultar el manual de uso y cuidado.

¿Se debe aumentar gradualmente el flujo y la temperatura al poner en marcha las columnas?

Es obligatorio aplicar una rampa de flujo para las columnas analíticas de GPC, en particular de aquellas de la serie HR. Un aumento repentino del flujo (y, por consiguiente, de la presión) seguramente dañará las columnas. El aumento de temperatura en rampa no es tan crítico. Por lo general, el flujo se aumenta de 0.0 a 1.0 mL/min en un intervalo de 60 segundos, y la temperatura se aumenta desde temperatura ambiente hasta 150 ºC (como ejemplo) durante varias horas.

¿Cómo se elige el intervalo de tamaños de poro de mis columnas?

El intervalo de tamaño de poro se elige determinando el intervalo de peso molecular aproximado de la muestra de interés. Por ejemplo, en caso de saber que el intervalo de peso molecular es bajo (como una resina epoxi), entonces se debería utilizar un conjunto de columnas de 103, 500, 100 y quizás una columna de 50 Å. Si la muestra de interés es un PVC de peso molecular medio, se utilizarán los conjuntos 103, 104 y 105. Elegir tamaños de poros individuales enfocados en el intervalo de pesos moleculares del polímero proporciona la más alta resolución. Si el intervalo de pesos moleculares no se conoce o es muy amplio, es recomendable utilizar columnas de lecho mixto (es decir, "lineales" o de "intervalo extendido"), las cuales proporcionan una mezcla de tamaños de poro.

¿Qué es la resolución y cuánta se necesita?

En el análisis por GPC, la resolución implica la separación de un rango de pesos moleculares en un voluemn incremental de elución. Es necesario maximizar esto siempre que sea posible. La forma más fácil de maximizar esto es agregando más columnas (y, por lo tanto, tiempo de análisis, lamentablemente). Otra manera es utilizar partículas de menor tamaño (~5 μm), lo que aumentará la eficacia. La compensación aquí es la durabilidad y la vida útil de la columna. En las separaciones en las que hay oligómeros, aditivos o distribuciones multimodales, la resolución puede ser importante. Si la muestra es de polietileno de alta densidad con una distribución amplia, la resolución puede no ser tan importante.

Waters fabrica columnas de alta resolución como la serie HR con partículas de 5 μm, la serie HT con partículas de ~10 μm (adecuada para trabajos a altas temperaturas y varios cambios de eluyente) y la serie HMW con partículas de 20 μm. Estas son buenas para muestras de muy alto peso molecular en las que el cizallamiento es un problema y la resolución no es tan crítica.

¿Qué es un patrón “estrecho”? ¿Qué es un patrón “amplio”?

• Los patrones "estrechos" son aquellos en los que la polidispersidad es inferior a ~1.10. La polidispersidad se define como la relación entre el peso molecular promedio en peso (Mw) y el peso molecular promedio en número (Mn).
• Los patrones "amplios" poseen polidispersidades superiores a 1.10 y suelen ser del mismo polímero que la muestra que se va a analizar.

En caso de utilizar patrones “estrechos”, ¿es posible inyectar más de un patrón a la vez?

En la GPC convencional con detección por RI, es ciertamente aceptable inyectar una mezcla de patrones, siempre que haya suficiente resolución entre los patrones eluidos. Sugerimos un máximo de tres patrones. Con la detección avanzada, como la viscosimetría, en la que es necesario conocer con exactitud el área bajo la curva del patrón, se debe inyectar un patrón a la vez.

¿Qué patrones se deben utilizar para el polímero?

Para la mayoría de las personas, una calibración "relativa" con patrón estrecho está bien. En este caso, los patrones de poliestireno son la elección habitual para la GPC orgánica, pero se pueden utilizar patrones estrechos de PMMA, poliisoprenos, polibutadienos y politetrahidrofuranos. Para la GPC acuosa, se dispone de óxidos de polietileno, polietilenglicoles y pululanos (polisacáridos) estrechos. Si el usuario necesita el peso molecular "verdadero" (en caso de que la solución de calibración no sea lo suficientemente buena), se puede utilizar el patrón amplio (o referencia) con la misma naturaleza química que las muestras.

¿Qué tan confiables son los patrones amplios?

En la mayoría de los casos, los patrones amplios disponibles comercialmente han sido bien caracterizados mediante técnicas que proporcionan un Mw, Mn, Mz, etc. razonable. Al adquirir estos patrones, existe cierta confianza en que los valores indicados son exactos y se obtienen con una precisión excelente. Después de todo, la curva de calibración se basa en estos valores. También se puede enviar una muestra representativa típica de las muestras analizadas en el laboratorio para su análisis mediante dichas técnicas auxiliares. Muchos laboratorios contratados y universidades pueden realizar estos análisis y proporcionar un Mn, Mw, Mz, etc. para la muestra que se desea utilizar como patrón amplio.

¿Se pueden utilizar los valores k y alfa del manual de polímeros?

El concepto de calibración universal, que consiste en desarrollar una calibración en función del volumen hidrodinámico logarítmico en lugar del peso molecular logarítmico, permite obtener pesos moleculares "absolutos" para las muestras desconocidas. Un gráfico de logaritmo [viscosidad intrínseca] frente a logaritmo [peso molecular] da como resultado lo que se denomina gráfico de "Mark-Houwink" o "ley de viscosidad". La pendiente de esta curva es alfa y la intersección determina k (son las denominadas constantes de Mark-Houwink). En ausencia de un detector de viscosímetro en línea, se pueden emplear las constantes de Mark-Houwink, siempre que sean bien conocidas no solo para los patrones estrechos a fin de desarrollar la calibración universal, sino también para las muestras desconocidas. Los valores indicados en el manual de polímeros deben corresponder con el polímero de interés correcto, con el intervalo de peso molecular correcto, en el eluyente que se está utilizando y a la temperatura de funcionamiento.

¿Cómo se prepara la fase móvil?

En la mayoría de los casos, el único paso necesario para preparar la fase móvil es la filtración. El eluyente se debe filtrar a través de un filtro de fluorocarbono de 0,45 μm (micras) (tipo de acetato para GPC acuosa).

¿Qué aditivos son importantes y cuándo se deben utilizar?

En ciertos casos, se requiere algún aditivo para fase móvil. Por ejemplo, se agrega bromuro de litio 0,05 M a los eluyentes polares como DMF, DMAc y NMP. Estos eluyentes polares se utilizan para analizar polímeros polares, como poliuretanos o poliimidas, y se produce una interacción dipolar que hace que aparezcan hombros artificiales en el extremo de la distribución de alto peso molecular. Esta interacción se elimina al agregar la sal. En el análisis de poliolefinas a alta temperatura, se debe agregar aproximadamente un gramo por cada 4 litros de un antioxidante (la mayoría de los fenoles impedidos estéricamente) a la fase móvil (TCB, por ejemplo). Esto ayudará a reducir la oxidación de la muestra, ya que se encuentra en el carrusel de muestras a alta temperatura antes de la inyección.

¿Cómo se preparan las muestras? (es decir, temperatura, tiempo y mezcla)

La pregunta principal antes de intentar realizar un análisis por GPC es: ¿en qué es soluble la muestra? Waters comenzó como una empresa que fabricaba GPC y hemos desarrollado una larga lista de eluyentes y temperaturas para casi todos los polímeros que se han utilizado en GPC. El tiempo que tarda la muestra en disolverse (ya sea a temperatura ambiente o elevada) suele depender de dos factores: el peso molecular y la cristalinidad. Cuanto más alto es el peso molecular y más cristalino es el polímero, más tiempo tarda en disolverse. Por lo general, la muestra se disuelve en dos o tres horas, con una ligera agitación. En algunos casos (por ejemplo, polietileno de peso molecular ultraalto) se requieren varias horas. Se debe evitar la mezcla a alta velocidad, la disolución por ultrasonido y la disolución en microondas, a menos que se lleven a cabo sin que el polímero se degrade.

¿Qué concentración y volumen de inyección se deben utilizar?

Como regla general, se debe preparar un polímero con un peso molecular máximo de 100 000 en el eluyente a una concentración de ~0,10 % a 0,12 % (peso/volumen). Esto representa aproximadamente de 1 a 1.2 mg de muestra (o patrón) por mL de eluyente. A medida que aumenta el peso molecular, la concentración debe disminuir en consecuencia. Un polímero de alto peso molecular (por ejemplo, peso promedio de ~3 000 000) se debe analizar a una concentración del <0,02 % (p/v). Por otro lado, una resina epoxi con un peso molecular <1000 se puede analizar a una concentración del 0.20 %.

A estas concentraciones, el volumen máximo de inyección por columna de 7,8 x 30 mm no debe superar los 100 μL.

¿Qué ventajas aporta tener un viscosímetro y/o un detector de dispersión de luz en línea?

A medida que los químicos que caracterizan polímeros desean obtener más información sobre sus muestras específicas, más personas se inclinan por las técnicas de "detección avanzada". Tener un viscosímetro en línea con el detector de índice de refracción brinda tres ventajas principales en comparación con tener solamente un RI:

• Peso molecular "absoluto" mediante calibración universal
• Viscosidad intrínseca del polímero a lo largo de la distribución
• Información de ramificación en relación con la ramificación de cadena larga

El detector de dispersión de la luz permitirá obtener lo siguiente:

Peso molecular promedio ponderado (Mw) "absoluto" sin establecer un radio de giro de la curva de calibración de la información de ramificación tanto para el polímero como para el viscosímetro.