Guía de iniciación a UPLC

La resolución cromatográfica, en su sentido más básico, es simplemente la anchura [w] de dos picos en relación con la distancia [t_R,2–t_R,1] entre dichos picos. Si se pueden estrechar o separar esos picos, puede mejorarse la resolución.

La resolución puede expresarse matemáticamente en términos más adecuados en forma de ecuación de resolución fundamental. La ecuación de resolución se compone de parámetros físicos y químicos que afectan a la resolución cromatográfica, eficacia [N], selectividad [α] y capacidad de retención [k]. La selectividad y la capacidad de retención son factores químicos que históricamente han sido más fáciles de manipular para mejorar la resolución. Estos parámetros pueden verse afectados por cambios como la temperatura, el eluyente de elución, la composición de la fase móvil y la química de la columna. La eficacia es un parámetro físico [mecánico] que es más difícil de manipular debido a la influencia de la raíz cuadrada en la resolución. Sin embargo, la eficacia puede tener un impacto significativo en la resolución si el tamaño de partícula es muy pequeño. La tecnología UPLC se centra en mejorar la resolución mediante partículas inferiores a 2 µm para mejorar la eficacia del sistema.

Se puede entender mejor cómo afectan estos parámetros a la resolución si se piensa en la forma en que estos tres términos se representan cromatográficamente [Figura 15]. La capacidad de retención [k] y la selectividad [α] son factores químicos que mueven los picos entre sí y son una medida de la interacción de los analitos con la fase estacionaria y la fase móvil. Podemos mejorar la resolución al aumentar k. Sin embargo, se obtienen tiempos de retención más largos, menor sensibilidad y anchuras de pico más amplias. Un aumento en α puede dar como resultado una mayor resolución, el mismo orden de elución de los picos en un período de tiempo similar o un cambio en el orden de elución. La eficacia [N] es una medida física del ensanchamiento de banda en una separación. Si se supone que N mejora al reducir el tamaño de las partículas del material de relleno, la distancia de los picos de centro a centro no cambia. Además, una reducción en el tamaño de las partículas dará como resultado picos cromatográficos más estrechos y eficientes, lo que mejorará la resolución y la sensibilidad.

Relación entre resolución, eficacia y tamaño de partícula

La tecnología UPLC maximiza la contribución física [mecánica] a la resolución minimizando el ensanchamiento de banda del instrumento, lo que permite el uso de columnas de partículas más pequeñas y de mayor eficacia [1,7 µm-1,8 µm]. Con ejemplos cromatográficos simples y aritmética básica, se puede obtener una mejor comprensión de los principios cromatográficos de la tecnología UPLC.

Como se indica en la ecuación de resolución fundamental, la resolución es directamente proporcional a la raíz cuadrada de la eficacia.

Además, la eficacia es inversamente proporcional al tamaño de las partículas. Esto significa que, si se reduce el tamaño de las partículas del material de relleno, aumenta la eficacia de la separación. Por ejemplo, si el tamaño de las partículas del material de relleno se reduce de 5 µm a 1,7 µm [3´], la teoría predice que la eficacia debería aumentar 3´, lo que da como resultado un aumento de 1,7´ en la resolución [raíz cuadrada de 3].

Para lograr las ventajas de eficacia y resolución predichas por la teoría, se debe analizar el flujo óptimo con respecto al tamaño de partícula. El flujo óptimo [F_opt] es inversamente proporcional al tamaño de las partículas. Esto significa que, si el tamaño de partícula se reduce de 5 µm a 1,7 µm [3´], el flujo óptimo para analizar esa partícula aumenta 3´, lo que da como resultado una reducción del tiempo de análisis en el mismo grado [3´]. aumentando así la velocidad de análisis de las muestras.

Uno de los primeros aspectos que observamos como cromatógrafos es lo que sucede cuando se cambia el flujo cromatográfico. Si el flujo aumenta, el tiempo de análisis disminuye. Además, la anchura del pico también disminuye. A medida que la anchura del pico se vuelve más estrecha, la altura de ese pico aumenta de manera proporcional. Los picos más estrechos que son más altos son más fáciles de detectar y diferenciar del ruido de la línea base [mayor S/N], lo que da como resultado una mayor sensibilidad.

Estos principios teóricos se aplicaron cromatográficamente. Como se observa en la Figura 20, cuando se minimiza el ensanchamiento de banda fuera de la columna como en el instrumento ACQUITY UPLC, se puede obtener el rendimiento teórico de una columna.

El análisis anterior demuestra la importancia del ensanchamiento de banda dentro de la columna. Al comprender mejor qué procesos influyen en el ensanchamiento de banda y cómo reducirlo, se pueden obtener mejoras en la eficacia y, por lo tanto, en la resolución.

Acerca de las curvas de Van Deemter

Como se describió anteriormente, la anchura de un pico se puede considerar como una distribución estadística de las moléculas del analito [variación, σ²]. La anchura del pico aumenta linealmente en proporción a la distancia recorrida por ese pico. La relación entre la anchura del pico y la distancia recorrida por ese pico es un concepto llamado altura equivalente a un plato teórico [HETP o H]. Procedente de la teoría de la destilación, H es una medida del rendimiento de la columna que tiene en cuenta varios procesos relacionados con el ensanchamiento de banda. Para expresarlo en términos que puedan resultar más familiares, cuanto más pequeño es el HETP, más platos [N] hay en una columna [Figura 21].

Al analizar lo que ocurre a nivel molecular dentro de una columna [cómo interactúan las moléculas del analito con la fase móvil y la fase estacionaria], se pueden comprender mejor los diferentes procesos relacionados con la difusión que contribuyen al rendimiento cromatográfico [Figura 22].

Hay varios procesos relacionados con la difusión que se producen simultáneamente:

1. Las moléculas de analito se transportan a la superficie de la partícula y alrededor de esa partícula [difusión en remolino]
2. Las moléculas de analito se difunden hacia adelante y hacia atrás en la fase móvil en masa [difusión longitudinal]
3. Las moléculas de analito se difunden dentro y fuera de los poros cromatográficos [transferencia de masa].

Estos procesos relacionados con la difusión se pueden expresar matemáticamente mediante la ecuación de Van Deemter.

La ecuación de Van Deemter se compone de tres términos:

• El término A [difusión en remolino] se relaciona principalmente con el tamaño de las partículas del material de relleno. Su valor también está determinado por el grado de relleno del lecho cromatográfico. También está relacionado con la uniformidad o no uniformidad del flujo hacia y alrededor de una partícula.
• El término B [difusión longitudinal] se relaciona con la difusión del analito en la fase móvil general y en la fase estacionaria, y disminuye al aumentar la velocidad de la fase móvil [velocidad lineal].
• El término C [transferencia de masa] está relacionado tanto con la velocidad lineal [la velocidad de la fase móvil] como con el cuadrado del tamaño de partícula. La transferencia de masa es la interacción de las moléculas de analito con la superficie interna de la fase estacionaria y su distancia de difusión dentro y fuera de los poros del material de relleno.

Estos términos se pueden observar individualmente trazándolos en una escala de HETP frente a la velocidad lineal [u] de la fase móvil [Figura 24].

El término A se representa como una línea horizontal. Está relacionado con el tamaño de las partículas y con el relleno de la columna, y es independiente de la velocidad lineal [velocidad de la fase móvil]. A medida que disminuye el tamaño de las partículas del material de relleno, también disminuye el valor H [mayor eficacia].

El término B se representa como una curva de pendiente descendente con una velocidad lineal creciente. Este término es independiente del tamaño de partícula e indica que si la fase móvil se mueve a una velocidad lineal más lenta, las moléculas del analito permanecen en la columna durante más tiempo y, por lo tanto, existe una mayor oportunidad de propagación [difusión] de banda a lo largo de la columna. Por el contrario, si la fase móvil se mueve a una velocidad lineal más rápida, hay menos tiempo para la difusión y, por lo tanto, hay menos tiempo para que se produzca el ensanchamiento de banda.

El término C se representa como una relación lineal creciente entre H y u. Entre una distribución de moléculas, algunas moléculas entran en un poro en fase estacionaria, mientras que otras permanecen en la fase móvil en movimiento hasta que alcanzan otra partícula. A esto le sigue el proceso inverso, en el que las moléculas inmovilizadas se separan y se desplazan hacia abajo en el lecho cromatográfico. Se necesita tiempo para que una molécula entre y salga de los poros y, por lo tanto, a medida que las moléculas se transfieren de una partícula a la siguiente, la banda de analito que contiene esas moléculas se ensancha a medida que avanza a lo largo de la columna. Cuanto más pequeñas son las partículas de la fase estacionaria, más rápido se produce este proceso para evitar que la banda del analito se ensanche. Si la fase móvil se mueve rápido, se desarrolla una mayor distancia entre las moléculas inmovilizadas y las que avanzan. Esto indica que para que la población de moléculas de analito permanezca unida, la fase móvil debe moverse a una velocidad lineal más lenta. A medida que aumenta la velocidad de la fase móvil, la población de moléculas de analito se vuelve más dispersa, lo que aumenta el ensanchamiento de banda.

Se forma una curva de Van Deemter al sumar los términos A, B y C [Figura 25]. Realizar una separación a la velocidad lineal a la que se produce el punto más bajo de la curva proporcionará la mayor eficacia y, por lo tanto, la resolución cromatográfica.

Si correlacionamos esto con la ecuación de Van Deemter que se muestra en la Figura 23, si el tamaño de partícula se reduce a la mitad, H se reduce en un factor de 2. Por tanto, es posible reducir el ensanchamiento de banda dentro de una columna utilizando partículas más pequeñas.

Por ejemplo, la Figura 26 representa un gráfico de Van Deemter de una partícula de 10 µm y una partícula de 5 µm. Como se observa en el gráfico, una partícula grande de 10 µm tiene un intervalo de operación óptimo muy estrecho con respecto a la velocidad lineal, para lograr el valor H más bajo [18 µm a 0,7 mm/s]. Si la velocidad de la fase móvil es demasiado lenta o demasiado rápida, se observa un aumento de H [pérdida de eficacia], lo que reduce la resolución y la sensibilidad cromatográficas. Sin embargo, la partícula de 5 µm presenta un valor H mucho más bajo, [10 µm a 0,95 mm/s; mayor eficacia] a una mayor velocidad de la fase móvil, así como a un intervalo de velocidades lineales mayor en el que se puede alcanzar ese valor H. Esto significa que se puede lograr una mayor eficacia y, por lo tanto, una resolución en un tiempo más rápido que con una columna rellena con partículas más grandes de 10 µm.

Para comprender mejor este efecto, se puede investigar más a fondo la influencia del tamaño de partícula en los términos individuales de la ecuación de Van Deemter.

El tamaño de las partículas tiene un impacto significativo en la banda del analito, ya que se relaciona con el término A [difusión en remolino]. La trayectoria que toman las moléculas de analito para transferirse desde la fase móvil a la superficie de la partícula y alrededor de esa partícula tarda menos tiempo a medida que disminuye el tamaño de esta. Las partículas más grandes hacen que las moléculas de analito se desplacen por trayectorias más largas e indirectas. Las diferencias en estas rutas dan lugar a tiempos de migración diferentes para las moléculas de analito dentro de una población, lo que da como resultado una banda de analito y un pico resultante más anchos. A medida que disminuye el tamaño de las partículas del relleno, se recomienda que las trayectorias de las moléculas de analito sean más similares en longitud. Esto da como resultado bandas de analito más estrechas, lo que se traduce en picos más estrechos, mayor eficacia y mayor sensibilidad [Figura 27].

La difusión longitudinal, el término B, no se ve afectada directamente por el tamaño de las partículas. Sin embargo, a medida que disminuye el tamaño de las partículas, los otros parámetros de la ecuación de Van Deemter, los términos A y C, se vuelven más pequeños. En consecuencia, la velocidad lineal óptima [velocidad de la fase móvil] aumenta, lo que reduce las oportunidades de ensanchamiento de banda. Una velocidad lineal más lenta permite que la banda de moléculas de analito interactúe con el material de relleno durante un período de tiempo más largo. Esto significa que hay más tiempo para la difusión axial [longitudinal] en la fase móvil, lo que da como resultado bandas de analito más amplias y difusas. A mayor velocidad lineal, la población de moléculas de analito se barre a través de la columna en un período de tiempo más corto, lo que permite que la banda de analito permanezca más concentrada, lo que da como resultado picos de mayor eficacia debido al menor tiempo de difusión longitudinal [Figura 28].

El término C [transferencia de masa] se ve afectado tanto por la velocidad lineal como por el tamaño de las partículas. Las poblaciones de moléculas de analito se transportan desde la fase móvil hasta la superficie de la partícula. A continuación, las moléculas de analito se mueven a través de la fase móvil en los poros hasta la capa de superficie unida (p. ej., C₁₈, C₈, etc.), interactúan con la fase unida y luego se arrastran fuera del poro hacia la fase móvil en masa. Sin embargo, las moléculas de analito dentro de la población entran y salen del poro en diversos grados. Eso significa que, a medida que las moléculas vuelven a la fase móvil en masa, la longitud de la trayectoria en la que se ha desplazado cada molécula de analito es diferente, lo que da como resultado un ensanchamiento [ampliación] de la banda del analito [Figura 29]. La cantidad de ensanchamiento de banda que se produce dependerá de la velocidad de la fase móvil [Figura 30].

A una velocidad lineal alta, el tiempo entre la interacción de las moléculas con la superficie de la partícula y la transferencia a través de la fase móvil es más prolongado. Cuanto más rápida sea la velocidad de la fase móvil, más rápido se moverán las moléculas de analito a través de la columna, lo que dará como resultado una banda de analito más ancha y menos concentrada. Esto se traduce en un pico cromatográfico más amplio y una menor sensibilidad.

A una velocidad lineal lenta, la longitud de los pasos entre las interacciones hasta la superficie es más corta. Esto da como resultado una banda de analito más concentrada, produciendo picos cromatográficos más estrechos y eficientes.

La transferencia de masa mejora drásticamente a medida que disminuye el tamaño de las partículas debido a su relación con el cuadrado del tamaño de las partículas [d_p²]. En el caso de las partículas más pequeñas, la molécula del analito tarda menos tiempo en penetrar en los poros, interactuar con la superficie cromatográfica y volver a pasar a la fase móvil. Por lo tanto, las moléculas de analito separadas en columnas de partículas más pequeñas se difunden mucho más rápido, lo que da como resultado una banda cromatográfica más nítida, más estrecha y más eficiente [Figura 31].

Por lo tanto, reducir el tamaño de las partículas mejorará la transferencia de masa, disminuyendo así de manera efectiva la pendiente del término C, lo que nos lleva a donde nos encontramos en estos momentos con la tecnología UPLC. Como se puede ver en el gráfico de Van Deemter de la Figura 32, las partículas de 1,7 µm proporcionan valores de HETP 2-3´ más bajos que las partículas de 3,5 µm. Además, estos valores de H más bajos se logran a una velocidad lineal más alta y en un intervalo más amplio de velocidades. Esto significa que la transferencia de masa mejora drásticamente con la partícula más pequeña, lo que permite una mayor eficacia y resolución. También significa que se puede utilizar un mayor intervalo de velocidades lineales para obtener este rendimiento mejorado. Las separaciones se pueden realizar a velocidades lineales más rápidas, lo que mejora la velocidad del análisis sin comprometer la resolución.

El impacto del ensanchamiento de banda [instrumento] fuera de columna en los gráficos de Van Deemter

A medida que la tecnología UPLC ha ganado impulso y popularidad en el laboratorio cromatográfico, los gráficos de Van Deemter han surgido como un método popular para medir las ventajas de rendimiento de partículas inferiores a 2 µm en relación con los tamaños de partículas de HPLC existentes. Se pueden obtener conclusiones erróneas si estas mediciones comparativas no se realizan en instrumentos que minimicen la contribución del ensanchamiento de banda fuera de la columna.

Para demostrar la importancia del ensanchamiento de banda fuera de la columna en la medición del rendimiento, se generaron gráficos de Van Deemter en un instrumento HPLC convencional [dispersión de banda = 7,2 µL], comparando partículas de 1,7 µm frente a 2,5 µm [Figura 33]. El sustrato de partículas y la química de la fase de enlace de las dos columnas eran idénticos. A primera vista, los gráficos de Van Deemter indican que no hay una diferencia apreciable en el rendimiento de estas dos columnas. ¿Cómo puede ser posible?

En este caso, el ensanchamiento de banda del instrumento de HPLC da como resultado una medición del rendimiento similar de la columna de UPLC de partículas de 1,7 µm con respecto a la columna de HPLC de 2,5 µm. Las anchuras de pico más pequeñas producidas por las columnas UPLC de partículas de 1,7 µm se ven más afectadas por el ensanchamiento de banda fuera de columna que las columnas rellenas con partículas más grandes [p. ej., de 2,5 µm], lo que genera este resultado erróneo.

A continuación, se llevó a cabo el mismo experimento en un instrumento ACQUITY UPLC [ensanchamiento de banda = 2,8 µL]. El instrumento ACQUITY UPLC tiene aproximadamente un 84 % menos de volumen del sistema y un 60 % menos de ensanchamiento de banda que el instrumento HPLC.

Como se puede ver en la Figura 34, se observa una diferencia notable en el rendimiento de estas dos columnas cuando se utilizan en el instrumento ACQUITY UPLC. Además de las diferencias observadas en HETP, la velocidad lineal óptima aumenta de 3,0 mm/s [partícula de 2,5 µm] a 10,0 mm/s [partícula de 1,7 µm], lo que demuestra las ventajas de rendimiento de HETP más bajo [mayor eficacia] y una velocidad lineal más rápida [y, por lo tanto, el rendimiento] asociado con la tecnología UPLC.

Mantener la integridad de la separación sin concesiones

Ahora que se ha establecido un conocimiento básico de las funciones del ensanchamiento de banda fuera de columna e intracolumna, podemos relacionar la medida de esos términos [HETP frente a velocidad lineal] de una manera más práctica: número de platos frente a flujo.

Como se detalló anteriormente, la velocidad lineal es la velocidad de la fase móvil a medida que fluye a través de la columna. Es un término que se utiliza para normalizar el flujo de la fase móvil independientemente del ID de la columna, de forma que se pueda medir y comparar el rendimiento de columnas con diferentes dimensiones. La velocidad lineal óptima está directamente relacionada con el flujo óptimo [Figura 35]. Las columnas HPLC convencionales solo pueden utilizarse en un intervalo de flujo estrecho para lograr un rendimiento óptimo. Si se trabaja fuera de este intervalo, es posible que se produzca una disminución del rendimiento.

Un enfoque común para reducir el tiempo de análisis [mejorar el rendimiento] en la HPLC convencional consiste simplemente en aumentar el flujo. Con partículas más grandes, aumentar el flujo a menudo da como resultado una pérdida sustancial de eficacia y, por lo tanto, de resolución, ya que ahora se trabaja por encima de la velocidad lineal óptima para la partícula de HPLC [cromatografía comprimida]. Este es un compromiso significativo entre el rendimiento cromatográfico y la velocidad de análisis asociado con la HPLC [Figura 36].

La tecnología UPLC no es propensa a estos compromisos. El tiempo de análisis se puede reducir sin sacrificar el rendimiento. Cuando el tamaño de las partículas se reduce de 3,5 µm a 1,7 µm, se observa un aumento significativo de la eficacia [Figura 37]. Esto se debe a las estrechas bandas cromatográficas que producen las columnas UPLC de partículas de 1,7 µm como resultado de un ensanchamiento insignificante de la banda dentro de la columna. Además, esta eficacia adicional se produce a un flujo más alto [Figura 37]. Esto significa que, para la misma longitud de columna, se puede lograr un aumento drástico en la eficacia y, por lo tanto, en la resolución en un tiempo de análisis más corto.

Acerca de la potencia de resolución de columnas [L/dp]

Al realizar una separación cromatográfica, el objetivo principal es separar un componente de otro para poder medir algunos o todos los componentes. El poder de resolución máximo de una columna se puede calcular dividiendo la longitud de la columna [L] por el tamaño de las partículas [d_p]. La relación L/d_p es particularmente útil cuando se intenta determinar qué material de relleno de tamaño de partícula y longitud de columna pueden ser necesarios para una aplicación determinada [Figura 38].

Esta ratio también se puede utilizar como herramienta para transferir métodos de un tamaño de partícula a otro. Una columna que tiene una ratio L/d_p de 30 000 [separación moderadamente difícil] es una selección muy común. Como se puede ver en la Figura 39, una columna de HPLC típica que produce un poder de resolución de 30 000 tiene 150 mm de longitud y está rellena con partículas de 5 µm. A medida que disminuye el tamaño de las partículas, se puede lograr el mismo poder de resolución en una columna más corta (lo que significa un tiempo de análisis más rápido; es decir, una columna de 50 mm de longitud rellena con partículas de 1,7 µm alcanza una ratio L/d_p de 30 000). Además de la longitud más corta de la columna, el flujo óptimo aumenta a medida que disminuye el tamaño de las partículas, lo que aumenta aún más el tiempo de análisis.

Esto se demuestra más claramente de forma cromatográfica [Figura 40]. Una columna UPLC de 50 mm de longitud rellena con partículas de 1,7 µm produce el mismo poder de resolución que una columna HPLC de 150 mm de longitud rellena con partículas de 5 µm. Al mantener constante la ratio L/d_p, el tiempo de análisis se reduce 10´ mientras se mantiene la resolución. Los flujos se ajustaron en proporción inversa a cada tamaño de partícula. Los volúmenes de inyección se ajustaron en proporción al volumen de la columna de forma que se inyectara la misma masa de carga en la columna.

Comprender la función de la ratio entre la longitud de la columna y el tamaño de las partículas [L/d_p] es clave para comprender la tecnología UPLC. La tecnología UPLC se basa en el empaquetado eficiente de partículas pequeñas y tolerantes a la presión en columnas cortas [de alto rendimiento] o largas [de alta resolución]. Estas columnas UPLC se utilizan en un instrumento LC diseñado para funcionar a la velocidad lineal [y la presión resultante] óptimas para estas partículas con un ensanchamiento de banda mínimo.

Medir el rendimiento de la separación en gradiente [Capacidad del pico]

En condiciones isocráticas, el número de platos [N] es una medida de las contribuciones acumuladas de ensanchamiento de banda del instrumento y la columna. Debido al ensanchamiento de banda relacionado con la difusión, la anchura de una banda de analito aumenta cuanto más tiempo se retiene la banda de analito en la fase estacionaria.

En un análisis en gradiente, la intensidad de elución de la fase móvil cambia a lo largo del análisis. Esto hace que las bandas de analito retenido más fuertes se muevan más rápidamente a través de la columna [cambiando así el tiempo de retención], manteniendo las bandas más concentradas [estrechas]. En la cromatografía de fase reversa, el aumento de la fuerza de elución de la fase móvil controla la anchura de las bandas que se producen, lo que da como resultado anchuras de pico similares a medida que las bandas pasan a través del detector. Debido a que la anchura de pico y el tiempo de retención se modifican por la fuerza cambiante de la fase móvil, el número de platos [debido a su relación con la anchura de pico] no es una medición válida para las separaciones en gradiente.

El poder de resolución [de separación] de un gradiente se puede calcular por su capacidad de pico [P_c]. Por consiguiente, la capacidad de los picos es simplemente el número teórico de picos que se pueden separar en un tiempo de gradiente determinado. La capacidad de los picos es inversamente proporcional a la anchura de los picos. Por lo tanto, para que P_c aumente, la anchura de pico debe disminuir.

La capacidad de los picos se puede aumentar drásticamente mediante la tecnología UPLC. El alto poder de resolución de la tecnología UPLC permite generar más información por unidad de tiempo aprovechando el poder de las partículas inferiores a 2 µm en instrumentos de ensanchamiento excepcionalmente bajo [ensanchamiento de banda de 2,8 µL]. Esto facilita que se pueda recopilar más información de una muestra determinada. Por ejemplo, una digestión con tríptico de fosforilasa b produce ~70 picos identificados utilizando una columna de HPLC rellena con partículas de 5 µm [Figura 43A]. Con la tecnología UPLC, el número de picos identificables aumenta de 70 a 168, lo que mejora la fiabilidad en la identificación de proteínas [Figura 43B].