Guía de iniciación a UPLC

Una combinación de muestras se transfiere de un vial de muestra a una corriente de sistema de fluidos en movimiento [fase móvil]. A continuación, la fase móvil transporta la muestra al cabezal de una columna cromatográfica mediante una bomba de alta presión. La fase móvil y la combinación de muestras inyectada entran en la columna, pasan a través del lecho de partículas y salen, transfiriendo la mezcla separada a un detector [Figura 3].

En primer lugar, analicemos cómo se separa la banda de la muestra en bandas de analito individuales [la dirección del flujo se representa mediante flechas verdes]. La Figura 4A representa la columna en el momento cero [el momento de la inyección], cuando la muestra entra en la columna y comienza a formar una banda. La muestra que aparece aquí, una mezcla de colorantes amarillo, rojo y azul, aparece en la entrada de la columna como una sola banda negra.

Después de unos minutos, durante los cuales la fase móvil fluye de manera continua y constante a través de las partículas del material de relleno, podemos ver que los colorantes individuales se han movido en bandas separadas a diferentes velocidades [Figura 4B]. Esto se debe a que existe una competencia entre la fase móvil y la fase estacionaria para atraer cada uno de los colorantes o analitos. Obsérvese que la banda de colorante amarilla se mueve más rápido y está a punto de salir de la columna. El colorante amarillo tiene mayor afinidad por [es atraído a] la fase móvil que los otros colorantes. Por lo tanto, se mueve a una velocidad más rápida, más cercana a la de la fase móvil. La banda de colorante azul tiene mayor afinidad por el material de relleno que la fase móvil. Su mayor atracción hacia las partículas hace que se mueva con notable lentitud. En otras palabras, es el compuesto más retenido en esta combinación de muestras. La banda de colorante rojo tiene una atracción intermedia para la fase móvil y, por lo tanto, se mueve a una velocidad intermedia a través de la columna. Debido a que cada banda de colorante se mueve a una velocidad diferente, podemos separar la mezcla cromatográficamente.

Cómo una banda cromatográfica se convierte en pico

Cada banda de analito específica está formada por muchas moléculas de analito. El centro de la banda contiene la mayor concentración de moléculas de analito; mientras que los bordes anterior y posterior de la banda tienen una concentración cada vez menor a medida que interactúan con la fase móvil [Figura 5].

A medida que las bandas de colorante separadas salen de la columna, pasan inmediatamente a un detector. El detector ve [detecta] cada banda compuesta separada sobre un fondo de fase móvil [véase la Figura 6]. Un detector adecuado [UV, ELS, fluorescencia, masa, etc.] tiene la capacidad de detectar la presencia de un compuesto y enviar su señal eléctrica correspondiente a una estación de datos informáticos, donde se registra como un pico. El detector responde a la concentración variable de moléculas de analito específicas dentro de la banda, donde interpreta el centro de la banda [la mayor población de moléculas de analito] como el máximo del pico.

¿Qué es un cromatograma?

Un cromatograma es una representación de la separación que se ha producido químicamente [cromatográficamente] en el sistema HPLC. Se dibuja una serie de picos que se elevan desde una línea base en un eje de tiempo. Cada pico representa la respuesta del detector para un compuesto diferente. La estación de datos del ordenador traza el cromatograma [véase la Figura 6]. La banda amarilla pasa por completo a través de la celda de flujo del detector; la señal eléctrica generada se envía a la estación de datos del ordenador. El cromatograma resultante comienza a aparecer en la pantalla. Obsérvese que el cromatograma se inicia cuando se inyecta la muestra por primera vez y aparece en forma de línea recta cerca de la parte inferior de la pantalla. Esto se denomina línea base; representa la fase móvil pura que atraviesa la celda de flujo a lo largo del tiempo. A medida que la banda amarilla del analito pasa a través de la celda de flujo, se envía una señal al equipo informático [que varía en función de la concentración de las moléculas del analito]. La línea se curva, primero hacia arriba y después hacia abajo, en proporción a la concentración de colorante amarillo en la banda de la muestra. Esto crea un pico en el cromatograma. Una vez que la banda amarilla sale por completo de la celda del detector, el nivel de la señal vuelve a la línea base; la celda de flujo ahora tiene, una vez más, solo fase móvil pura. Debido a que la banda amarilla se mueve más rápido, eluyendo primero de la columna, es el primer pico que se extrae. Poco después, la banda roja llega a la celda de flujo. La señal aumenta desde la línea base cuando la banda roja entra por primera vez en la celda y comienza a dibujarse el pico que representa la banda roja. En este diagrama, la banda roja no ha pasado por completo a través de la celda de flujo. El diagrama muestra cómo se vería la banda roja/pico si se detuviera el proceso en este momento. Dado que la mayor parte de la banda roja ha pasado a través de la celda, se ha trazado la mayor parte del pico, como muestra la línea continua. Si continuáramos con el proceso cromatográfico, la banda roja pasaría por completo a través de la celda de flujo y se completaría el pico rojo [línea de puntos]. La banda azul, la más retenida, es la que se desplaza a menor velocidad y eluye después de la banda roja. La línea de puntos muestra cómo se vería el cromatograma completo de haber dejado que el análisis continuara hasta su conclusión. Cabe destacar que la anchura del pico azul será la más amplia porque la anchura de la banda del analito azul, aunque es más estrecha en la columna, se vuelve más ancha una vez que sale de la columna. Esto se debe a que se mueve más lentamente a través del lecho de material de relleno cromatográfico y requiere más tiempo [y volumen de fase móvil] para eluirse por completo. Dado que la fase móvil fluye de forma continua a una velocidad fija, la banda azul se ensancha y se diluye más. El detector responde en proporción a la concentración de la banda; por lo tanto, el pico azul tiene una altura menor y una anchura mayor.

Ensanchamiento de banda

Antes de que la banda de la muestra/analito llegue al detector, pasará a través de varios componentes del sistema cromatográfico que contribuirán a la distorsión y al ensanchamiento de la banda cromatográfica [Figura 7]. Este fenómeno se llama ensanchamiento de banda. A medida que la banda del analito se ensancha, aumenta la anchura del pico cromatográfico resultante. La banda más ancha genera un efecto de dilución que produce una disminución en la altura del pico acompañada de una pérdida de sensibilidad y resolución. Por otro lado, si se minimiza el ensanchamiento de banda, se obtienen bandas cromatográficas más estrechas, lo que aumenta la eficacia. Estos picos cromatográficos más altos y estrechos son más fáciles de ver para el detector, lo que permite una mayor sensibilidad y resolución debido a una banda de analito más concentrada. Por lo tanto, es importante conocer los factores que influyen en el ensanchamiento de banda con el fin de reducir y controlar esas influencias para mejorar el rendimiento cromatográfico general.

Dentro de un sistema cromatográfico, tanto las influencias de la columna como fuera de ella [todo lo que está fuera de la columna] contribuyen al ensanchamiento de banda. Las fuentes fuera de columna incluyen el volumen de inyección, la trayectoria de fluidos del instrumento entre el inyector de muestras y la columna, y desde la salida de la columna hasta el detector [incluida la celda de flujo] y todas las conexiones incluidas en el mismo. Las fuentes de la columna de ensanchamiento de banda incluyen el tamaño de partícula del material de relleno, cómo está relleno el material dentro de la columna y sus características de difusión en relación con la velocidad de la fase móvil, el tamaño del analito y la geometría. La suma de las variaciones (σ2) para cada uno de estos contribuyentes afecta a la anchura de un pico [Figura 8].

Para obtener un rendimiento significativamente mejorado en la cromatografía líquida, es necesaria una reducción en las influencias de ensanchamiento de banda tanto fuera de columna como de columna. El sistema ACQUITY UPLC se basa en el concepto de reducir ambas formas de ensanchamiento de banda, de forma que se puedan lograr mejoras rentables en la eficacia y la sensibilidad [Figura 9].

Acerca del ensanchamiento de banda fuera de columna [Instrumento]

Con el fin de mejorar significativamente el rendimiento cromatográfico, se llevó a cabo un importante trabajo de ingeniería para diseñar un instrumento de LC que pudiera adaptarse a las presiones producidas por los empaquetados de partículas pequeñas [menos de 2 µm], minimizando al mismo tiempo la dispersión de la trayectoria del flujo, de manera que se pudiera alcanzar el rendimiento teórico de la columna de separación. También es importante que el instrumento sea una herramienta analítica fiable, robusta y precisa para el uso sistemático en el laboratorio. Para demostrar la importancia del diseño del instrumento, es necesario comprender cómo la dispersión del sistema [instrumento + ensanchamiento de banda de la columna] puede afectar a los resultados cromatográficos.

La medición del número de platos [N], o eficacia, tiene en cuenta la dispersión de un pico. La anchura de un pico está directamente relacionada con la anchura de la banda del analito a medida que atraviesa el detector, mientras que el máximo de ese pico es el punto en el que se produce la mayor concentración de moléculas de analito dentro de esa banda. Esta medición se lleva a cabo en condiciones isocráticas.

La ecuación del número de platos se puede calcular como se muestra en la Figura 10, donde [Vn] es el volumen de elución del pico, [w] es la anchura del pico y [a] es una constante que se determina en función de la altura del pico a la que se mide la anchura del pico. Cada método de medición de la anchura de los picos producirá resultados idénticos en el número de platos, siempre que el pico sea perfectamente simétrico. Si el pico muestra algún frente o cola, estos métodos de medición generarán resultados diferentes.

Es un error común pensar que el número de platos se refiere únicamente al rendimiento alcanzado por la propia columna. Sin embargo, el ensanchamiento de banda tanto de la columna como del instrumento también influye en la anchura del pico a partir del cual se determina el número de platos. Para demostrar la influencia del propio instrumento en el ensanchamiento de la banda, se analizó una sola columna de HPLC en dos instrumentos diferentes; un HPLC estándar [ensanchamiento de banda = 7,2 µL] y un sistema ACQUITY UPLC [ensanchamiento de banda = 2,8 µL]. Dado que se analiza la misma columna en ambos sistemas, la contribución de ensanchamiento de banda de la columna se mantiene constante. El aumento de la eficacia que se observa en el sistema ACQUITY UPLC demuestra cómo un instrumento con menos ensanchamiento de banda genera anchuras de pico más estrechas, lo que da como resultado un mayor número de platos [Figura 11].

Influencia de la longitud y el diámetro de los tubos

Una vez que la banda de muestra se introduce en la corriente de fluidos, se desplaza a la columna. El sistema de gestión de muestras ACQUITY UPLC se ha diseñado para minimizar la distancia entre el inyector y la entrada de la columna con el fin de minimizar el ensanchamiento de banda. La columna separa la banda de la muestra en bandas de analito individuales. A continuación, las bandas de analito separadas cromatográficamente se transfieren de la columna al detector. En un primer momento, es posible que no se tenga en cuenta la importancia del diámetro interno [DI] del tubo que conecta la salida de la columna y la entrada del detector. No obstante, este puede afectar en gran medida al ensanchamiento de banda del instrumento [Figura 12].

Como es de esperar, el ensanchamiento de banda disminuirá al disminuir el diámetro interno del tubo. Al hacer fluir una banda de analito concentrada en un tubo de diámetro interno grande, la banda se volverá mucho menos concentrada, lo que dará como resultado un pico más ancho y distorsionado y una disminución de la sensibilidad. Además, la fricción a lo largo de las paredes del tubo hará que las moléculas de analito en contacto con las paredes del tubo se muevan más lentamente que las moléculas en el centro del tubo, lo que da como resultado un perfil de banda distorsionado. La distancia entre el centro y los bordes exteriores de la banda del analito disminuye a medida que disminuye el diámetro interno del tubo. Esto reduce la cantidad de distorsión en la banda. Además, es importante minimizar la longitud del tubo, ya que una longitud excesiva también puede distorsionar una banda de muestra.

Impacto de la configuración del detector en el ensanchamiento de banda fuera de la columna

Además de las contribuciones de ensanchamiento de banda basadas en los fluidos del instrumento, los ajustes del detector digital relacionados con la velocidad de adquisición y la constante del filtro también influyen en el resultado cromatográfico. Esto tiene especial importancia para las aplicaciones UPLC, ya que las anchuras de los picos suelen ser muy estrechas [entre 1 y 2 segundos] y el tiempo de análisis puede ser muy corto. Al configurar la velocidad de adquisición del detector, la selección debe basarse en la adquisición de suficientes puntos de datos a través de un pico para representar correctamente el pico. Si se ajusta la velocidad del detector a un nivel demasiado alto, la relación señal-ruido se verá perjudicada, lo que hará que el ruido de la línea base aumente sin un incremento en la altura de la señal del analito de interés. Por otro lado, si se ajusta la velocidad de adquisición del detector a un nivel demasiado lento, se obtendrán puntos de datos inadecuados a través del pico, lo que reducirá la eficacia cromatográfica observada y afectará a la capacidad de realizar la cuantificación de forma reproducible. Además, se utiliza una constante de tiempo [filtro digital] para suavizar los puntos de datos con el fin de optimizar la relación señal-ruido y se puede utilizar junto con la velocidad de adquisición o independientemente de ella.

A medida que se reduce la anchura de la banda del analito, la configuración del detector gana importancia. Esto requiere una velocidad de adquisición que no solo sea lo suficientemente rápida como para crear digitalmente un pico de esa velocidad, sino también para representar correctamente la separación de alta resolución lograda en la columna UPLC, si existen picos de elución cercana.

A flujos más lentos, cuando los picos están más dispersos en el tiempo, estos ajustes son más tolerantes. Sin embargo, a medida que los picos se vuelven más estrechos y el análisis más rápido [como en las separaciones UPLC], se debe mantener un ajuste prudente de la velocidad de adquisición y la constante de tiempo [Figura 13]. Cuando se utiliza la tecnología UPLC para aplicaciones “reales”, es aconsejable seleccionar la velocidad de adquisición de datos del detector [Hz] que capture con precisión la forma del pico más estrecho y, a continuación, aplicar una constante temporal de filtrado [segundos] que proporcione una relación señal-ruido y una resolución óptimas para el análisis.