Guía de iniciación a la cromatografía de convergencia

El mecanismo básico de cualquier separación cromatográfica consiste en crear condiciones en las que todas las moléculas de analito de la mezcla de muestra se desplacen a través del sistema, pero a diferentes velocidades, de modo que, cuando se eluyan de la columna analítica, estén lo suficientemente separadas entre sí como para ser detectadas y cuantificadas. Para llevar a cabo este proceso, la cromatografía tiene dos componentes principales: una fase estacionaria y una fase móvil. La función principal de la fase estacionaria es detener o retener el movimiento del compuesto, mientras que la de la fase móvil es mantener los compuestos en el sistema y también provocar que se desplacen desde la entrada hasta la salida del sistema. Este es el mecanismo fundamental de GC, LC o CC. La principal diferencia entre CC y LC o GC es cómo las propiedades de la fase móvil influyen en sus respectivos comportamientos cromatográficos.

Papel de la fase móvil en la CC en comparación con la LC y la GC

En la GC, la fase móvil es normalmente un gas inerte o no reactivo, normalmente He o N₂. A las temperaturas y presiones de funcionamiento de la GC, la fase móvil no puede solvatar moléculas de analito ni modificar la superficie de la fase estacionaria. La fase móvil de la GC actúa principalmente como transportador o conductor de las moléculas del analito a través de la columna de la GC. La retención y separación del analito se produce únicamente a través de interacciones entre moléculas del analito con la fase estacionaria. Esto solo se produce a través de interacciones entre moléculas de analito con la fase estacionaria. Esto se muestra de forma esquemática en la figura 3 con el espacio vacío alrededor de las moléculas de analito.

En la LC, por otra parte, la fase móvil desempeña una función activa, en la que sus moléculas interactúan fuertemente tanto con las moléculas del analito como con la fase estacionaria. La fase móvil influye en la retención del analito no solo solvatando directamente los analitos, sino también influyendo en las interacciones entre el analito y la fase estacionaria al competir por la superficie de esta (figura 3). 

La figura 3 presenta la LC en los modos de RPLC y NPLC. Cabe destacar que una de las principales diferencias entre estos dos modos de LC está en la composición de la fase móvil: la RPLC es de base acuosa, mientras que la NPLC es de base orgánica. En la RPLC, la fase móvil de base acuosa, junto con la fase estacionaria C₁₈, modifica eficazmente las interacciones que tienen los analitos con la fase estacionaria, desempeñando así un papel importante en la resolución de analitos de la muestra en una amplia variedad de mezclas de compuestos. En el desarrollo del método de la RPLC, la primera modificación suele realizarse en la fase móvil, no en la fase estacionaria. En la NPLC, en cambio, la fase móvil basada en hexano o heptano desempeña un papel relativamente moderado, y la separación se produce en gran medida al variar la química de la fase estacionaria.

El papel de la fase móvil en la CC se encuentra a medio camino entre la RPLC y la NPLC debido a las propiedades únicas del CO₂, ya sea supercrítico o no. El CO₂ comprimido es apolar, como el heptano o el hexano. Basándose en eso, la CC se parece más a la NPLC. Sin embargo, una diferencia clave es que el CO₂ es capaz de mezclarse completamente con los coeluyentes polares, como el metanol, el etanol y el acetonitrilo, por lo que se pueden utilizar en modo de gradiente, a diferencia de la NPLC, que casi siempre se utiliza en modo isocrático. Además, las fases móviles de la CC son mucho más tolerantes a la presencia de pequeñas cantidades de agua que la NPLC, que puede desempeñar un papel importante en la elución del analito.

En la siguiente sección se presenta una comparación sistemática de la CC con la RPLC y la NPLC, basada en las diferencias entre las propiedades de sus principales eluyentes.

Papel de las propiedades del CO2 que afectan al comportamiento cromatográfico

Miscibilidad del CO2 con otros eluyentes

El CO₂ es un eluyente no polar con un índice de polaridad similar al del heptano (= 0,1). Pero a diferencia de este, el CO₂ tiene un momento cuádruple distinto de cero (–13·4 ± 0·4 × 10^–40 C m²) y es completamente miscible con los eluyentes orgánicos altamente polares, como el acetonitrilo (índice de polaridad = 5,8) y el metanol (índice de polaridad = 5,1). Aunque es poco miscible con agua (índice de polaridad = 10,2), es miscible con mezclas de metanol y agua, de isopropanol y agua o de acetonitrilo y agua que tengan proporciones considerables de agua. Un rango de miscibilidad tan amplio permite que la fase móvil de la CC extienda su polaridad en un rango más amplio que las fases móviles de la NPLC y la RPLC. La tabla 1 presenta una imagen concisa de la situación en términos de valores eluotrópicos (fuerza de elución) e índices de polaridad de los eluyentes utilizados en la RPLC, la NPLC y la CC.

En la tabla 1, se observa que la fase móvil de base acuosa de la RPLC solo puede emplear un rango limitado de la serie eluotrópica debido a la limitada miscibilidad del agua con la mayoría de los demás eluyentes orgánicos. De manera similar, para la NPLC, la fase móvil basada en hexano o heptano no permite un rango eluotrópico amplio, a causa de la limitada miscibilidad de los compuestos orgánicos no polares con los eluyentes altamente polares. Otro problema que plantea la NPLC es que ni siquiera todos los eluyentes orgánicos son ampliamente miscibles entre sí, lo que da lugar a la incompatibilidad de ciertas mezclas. Para la CC, por otro lado, el CO₂ comprimido es miscible con todos los demás eluyentes en toda la serie eluotrópica, lo que ofrece una amplia gama de opciones de fase móvil para influir en la selectividad de las separaciones (consultar la tabla 1). Aunque el CO₂ sea apolar, la CC es comparable a la RPLC, porque puede tener una fuerza eluotrópica mucho más amplia en comparación con la NPLC, especialmente en el lado de mayor polaridad. Por ejemplo, al combinar CO₂ con metanol, las fuerzas eluotrópicas de la fase móvil se pueden programar de 0 a 0,73 E^o.

Junto con el rango eluotrópico extendido, la fase móvil de la CC basada en CO₂ es compatible con el mayor número de químicas de fase estacionaria. La tabla 2 enumera las fases estacionarias comúnmente empleadas para la NPLC y la RPLC. La mayoría de las separaciones de la RPLC se realizan con fases estacionarias C₁₈ (se utilizan otras fases enlazadas en relativamente pocos casos). Algunas de las fases estacionarias enumeradas no se pueden utilizar en absoluto con la RPLC debido a su mayor polaridad. Del mismo modo, con la NPLC, la selección de columnas está limitada por el intervalo de polaridad de la fase móvil. Con la CC, debido a su intervalo de polaridad más amplio, la selección de todas estas composiciones químicas de la columna es posible, lo que abre una gama más amplia de opciones de selectividad (consultar la figura 4). Como señalaron West y Lesellier, como todos estas químicas pueden funcionar con la misma composición de fase móvil, se abre la interesante posibilidad de acoplar columnas de polaridades muy dispares.

Otra razón por la que la miscibilidad del CO₂ es importante es que el CC es compatible con una amplia gama de diluyentes de la muestra (eluyentes en los que se disuelve o se diluye la muestra). Esta función de la CC tiene un gran impacto en el flujo de trabajo general de un laboratorio. El mayor cuello de botella en un laboratorio cromatográfico suele ser la preparación de las muestras. Los métodos de preparación de muestras más habituales dan lugar a que los analitos de interés se disuelvan en un eluyente incompatible con el sistema de LC en cuestión. Por ejemplo, muchos analitos se disuelven fácilmente con un eluyente orgánico y, por lo tanto, es mejor extraerlos con dicho eluyente. Debido a que grandes cantidades de eluyentes orgánicos son incompatibles con la RPLC, a menudo se requieren pasos adicionales para que la solución orgánica o el extracto sean compatibles con la RPLC (figura 5). Puesto que la CC es compatible con la inyección directa de muestras disueltas en eluyentes orgánicos, ya no se precisan los pasos para la evaporación de eluyentes orgánicos y la tediosa reconstitución de la muestra en los diluyentes de base acuosa necesarios para las separaciones de fase reversa. Esto permite ahorrar costes en el global del ensayo. Además, el tiempo de análisis puede ser mucho más corto, lo que supone un importante impacto colectivo, especialmente para los laboratorios con varios sistemas RPLC en funcionamiento, configurados para analizar numerosas muestras.

En resumen, al combinar CO₂ comprimido apolar con un coeluyente en cualquiera de los extremos del espectro eluotrópico, junto con una mayor diversidad de fases estacionarias compatibles con la CC, se puede explorar un espacio de selectividad especialmente grande, lo que hace que la CC se pueda aplicar a una gran variedad de problemas de separación.

Propiedades de transporte de CO2

Otra ventaja de las propiedades de la CC es la baja viscosidad y la consiguiente alta difusividad que presentan las moléculas de analito en la fase móvil de la CC. Desde el punto de vista de las propiedades físicas, la eficacia de una columna cromatográfica está controlada por la difusividad del analito en la fase móvil. Cuanto mayor es la difusividad de una molécula, más rápido entra y sale de los poros de las partículas estacionarias, lo que da como resultado una alta eficacia incluso a una alta velocidad de la fase móvil. En la CC, incluso después de añadir volúmenes significativos de modificador líquido (por ejemplo, CO₂ y metanol, 70/30 % mol), la viscosidad de la fase móvil es al menos la mitad que la de las fases móviles de la LC (consultar la tabla 3). Esto significa que la CC puede funcionar a caudales de fase móvil mucho más altos, sin renunciar a la eficacia de la columna. Esto hace que la CC sea una gran candidata para análisis de alto rendimiento.

La ventaja de la CC en dos áreas clave de aplicación, el cribado quiral rápido y el reemplazo de la cromatografía de fase normal para las separaciones aquirales, es considerable. Para el cribado quiral, el tiempo de análisis se reduce de 20 a solo 3 minutos, siendo 7 veces más rápido y con un aumento de la resolución. Esta mejora se debió principalmente al uso de gradiente de eluyente en la CC, lo cual no se pudo realizar en la NPLC. Otro beneficio de la CC es que se consume menos eluyente, lo que se traduce en costes sustancialmente menores.

La sustitución de los eluyentes orgánicos de fase normal por una fase móvil compuesta principalmente de CO₂ comprimido (figura 6) reduce el coste por análisis de aproximadamente 6 dólares a solo 0,05 dólares por muestra. El impacto financiero general de la reducción de los tiempos de análisis, así como de los costes de compra y eliminación de eluyentes, es extraordinario.

La función de otras propiedades ventajosas

La tabla 4 enumera las ventajas de las fases móviles de la CC frente a las de LC. Además de las ventajas de la miscibilidad y la baja viscosidad, hay también una baja tensión superficial que permite que la fase móvil entre más rápido en los poros de las partículas de la fase estacionaria, lo que lleva a un equilibrado más rápido de la columna.

Otra de las propiedades del CO₂ que hacen que la CC sea altamente atractiva como sistema cromatográfico es que es más barato y seguro de utilizar, y más sostenible. El CO₂ es fácil de obtener y no depende de ningún otro proceso crítico (como el del acetonitrilo como subproducto de la industria petroquímica). El CO₂ de calidad comercial es neutro en carbono y es considerado un eluyente sostenible. El CO₂ cuesta mucho menos que otros eluyentes orgánicos y, si no se recicla, se puede liberar directamente a la atmósfera sin incurrir en gastos de eliminación.

El CO₂ no es inflamable ni tóxico, y es más fácil de almacenar. Es imposible encontrar una fase móvil que combine las propiedades del CO₂ (miscibilidad y baja viscosidad) y que sea tan económica y ecológica, lo que hace que la CC sea superior a la LC en muchos casos. El beneficio acumulado de todas estas propiedades, enumeradas en la tabla 4, hace que el CO₂ sea un eluyente único.

¿Supercriticidad sí o no?

Como se indicó anteriormente, desde un punto de vista cromatográfico no importa si la fase móvil es supercrítica o no en la CC. Sin embargo, para llevar a cabo la separación cromatográfica, es absolutamente necesario que la fase móvil de la CC sea homogénea y no una mezcla heterogénea de gas y líquido. Para garantizar que sea homogénea, la fase móvil en la CC se mantiene por encima de una cierta presión, lo cual se puede configurar fácilmente mediante un regulador de contrapresión automatizado (ABPR).