Guía de iniciación a la cromatografía de convergencia
Introducción
Desarrollo de la cromatografía de convergencia
1.1 La cromatografía de convergencia (CC) es una tecnología de separaciones que utiliza CO2 comprimido como eluyente principal en la fase móvil cromatográfica, a presiones de entre 100 y 400 veces la presión atmosférica. Generalmente, el CO2 se mezcla con coeluyentes líquidos, como el metanol, el etanol, el isopropanol o el acetonitrilo, para modular las propiedades de la fase móvil, de forma parecida a lo que se hace en cromatografía líquida de fase reversa (RPLC), donde estos coeluyentes se mezclan con agua para modular las propiedades de la fase móvil. Aquellos que estén familiarizados con la versión moderna de la cromatografía líquida supercrítica (SFC) no tardarán en ver el parecido entre la CC y la SFC. En realidad, la CC es una versión renombrada de la SFC moderna. Para entender bien de qué estamos hablando, es necesario mirar al pasado, concretamente al desarrollo de la SFC, lo cual haremos a continuación.
La SFC se inventó como una técnica cromatográfica que emplea eluyentes en condiciones supercríticas para ampliar la capacidad de la cromatografía de gases (GC). Para resolver el problema del análisis de compuestos que solo se eluyen a altas temperaturas pero que se descomponen térmicamente a esas temperaturas, Klesper y sus colaboradores emplearon presiones más altas en la GC para compensar el requerimiento de altas temperaturas. Se seleccionaron condiciones supercríticas para (a) el poder de solvatación de un gas a alta presión y (b) para evitar las condiciones en las que las fases móviles ya no fluyen como un solo eluyente (se someten a separación de fase de gas-líquida) variando la presión, la temperatura o ambas. Más tarde, descubrieron que, al variar la densidad del eluyente, se puede modular su fuerza, lo que es la principal ventaja de trabajar en condiciones supercríticas. Debido a que los fluidos son altamente compresibles en condiciones supercríticas, incluso los mínimos cambios en la presión cambian en gran medida la densidad del eluyente y, por lo tanto, también varía la retención de analito. De hecho, se puede crear un gradiente de eluyente variando la presión de funcionamiento que da lugar a la modulación de la densidad, eliminando la necesidad de mezclar coeluyentes orgánicos para crear un gradiente. La posibilidad de un modo único de separación con eluyentes no tóxicos despertó bastante interés y entusiasmo entre los científicos analíticos.
Sin embargo, el entusiasmo no duró, ya que poco a poco se comprendió que la modulación de la densidad, por muy útil que sea, puede no modificar la polaridad del eluyente lo suficiente como para ser ampliamente aplicable a la gama de compuestos que pueden separarse mediante otras potentes técnicas cromatográficas, como la cromatografía líquida de fase reversa (RPLC). El hecho es que el CO2, que se convirtió en el eluyente por excelencia para la SFC, sigue siendo un eluyente apolar incluso tras modular significativamente su densidad. Para separar la mayoría de los analitos polares, es necesario añadir coeluyentes polares como el metanol. Este descubrimiento cambió el curso del desarrollo de la SFC. Aunque hay muchas aplicaciones importantes que todavía dependen solo de la modulación de la densidad, los profesionales de la SFC comenzaron a confiar más en la mezcla de coeluyentes orgánicos líquidos y aditivos, igual como se hace en la RPLC, para lograr la separación de una variedad más amplia de analitos.
El CO2 es completamente miscible con eluyentes muy polares como el metanol, el etanol y el acetonitrilo, y a menudo se emplean gradientes de eluyentes que alcanzan composiciones modificadoras muy altas (del 60 %, por ejemplo). Estas prácticas plantearon continuamente preguntas sobre la supercriticidad de la fase móvil. A concentraciones más altas del modificador y a las temperaturas y presiones que se utilizan normalmente en la SFC, la fase móvil no es supercrítica durante la mayor parte de la duración del método. Y lo que es más importante: estas desviaciones de las condiciones supercríticas no suponen ninguna diferencia en la cromatografía. Entonces, ¿por qué una tecnología que no depende de que el eluyente alcance una condición supercrítica debería seguir conociéndose como cromatografía de fluidos supercrítica? Se ha sugerido cambiar de nombre a la versión moderna de la SFC; por ejemplo, «cromatografía de fluidos subcríticos y supercríticos», «cromatografía de fluidos simplificados», «separaciones mediante dióxido de carbono» o simplemente por sus siglas (SFC), pero ninguna hace justicia al alcance ampliado de su uso actual en laboratorios analíticos.
Así como a la confusión sobre su identidad, la SFC también se enfrentó a graves dificultades tecnológicas que impidieron que se utilizara seriamente como instrumento analítico. La robustez y reproducibilidad del método eran deficientes porque los instrumentos más antiguos no podían manipular un eluyente compresible como el CO2 de forma fiable y repetida, al menos no al mismo nivel que los instrumentos modernos de HPLC o UPLC.
Todo eso cambió en 2012, cuando Waters Corporation introdujo la cromatografía de convergencia Ultra Performance, o UPC2 (consultar la figura 1), para abordar tanto los problemas instrumentales como el asunto del nombre. Con una robustez instrumental considerablemente mayor, que se examinará en detalle en el capítulo 3, y un nuevo nombre para diferenciarla de las tecnologías más antiguas, la SFC finalmente se convirtió en una opción seria para los estudios analíticos.
Figura 1. El sistema ACQUITY UPC2.
¿Qué significa la «convergencia» en la cromatografía de convergencia?
La palabra «convergencia» de la cromatografía de convergencia viene de la idea de Giddings de tener una tecnología que convergiera las tecnologías cromatográficas existentes, la GC y la cromatografía líquida (LC), en un solo sistema. Giddings describió la SFC como una técnica para unir la LC y la GC, y para extender el uso de fases móviles más allá de los límites de la supercriticidad. La cromatografía de convergencia se suele usar ahora con coeluyentes orgánicos que abarcan regiones tanto supercríticas como subcríticas, y que se expanden más allá de la limitada modulación de densidad de la SFC con solo CO2. En lugar de cerrar simplemente la brecha entre la GC y la LC, el potencial de la SFC es mucho mayor de que se previó inicialmente.
