Guia para iniciantes em cromatografia líquida

Um tubo de coluna e conexões devem conter o material de retenção cromatográfico (fase estacionária) que é utilizar para realizar uma separação. Ele deve resistir à contrapressão criada durante a fabricação e em utilização. Além disso, deve fornecer um caminho de fluxo bem controlado (livre de vazamentos, volume mínimo e volume inativo zero) para a amostra em sua entrada e faixas de analito em sua saída, e ser quimicamente inerte em relação ao sistema de separação (fases móveis, estacionárias e de amostra). A maioria das colunas é construída em aço inoxidável para maior resistência à pressão. PEEK (um plástico de engenharia) e vidro, embora menos tolerantes à pressão, podem ser utilizados quando superfícies inertes são necessárias para aplicações químicas ou biológicas especiais. (Figura M-1).

Uma parede de coluna de vidro oferece uma vantagem visual. Na foto da Figura M-2, o fluxo foi interrompido enquanto as faixas de amostra ainda estão na coluna. É possível ver que os três corantes na mistura de amostra injetada já foram separados no leito; o analito amarelo, se deslocando mais rápido, está prestes a sair da coluna.

Desempenho de separação – Resolução

O grau em que dois compostos são separados é chamado de resolução cromatográfica (RS, Chromatographic Resolution). Os dois fatores principais que determinam o poder de separação ou a resolução geral que podem ser alcançados por uma coluna de HPLC são: poder de separação mecânica, criado pelo comprimento da coluna, pelo tamanho da partícula e pela uniformidade do leito preenchido, e poder de separação química, criado pela competição físico-química para compostos entre o material de retenção e a fase móvel. A eficiência é uma medida do poder de separação mecânica, enquanto a seletividade é uma medida do poder de separação química.

Poder de separação mecânica – Eficiência

Se um leito de coluna for estável e preenchido uniformemente, seu poder de separação mecânica será determinado pelo comprimento da coluna e pelo tamanho da partícula. O poder de separação mecânica, também chamado de eficiência, é frequentemente medido e comparado por um número de placa (símbolo = N). Leitos cromatográficos de partículas menores têm maior eficiência e maior contrapressão. Para um determinado tamanho de partícula, é possível assegurar mais poder de separação mecânica por meio do aumento do comprimento da coluna. No entanto, as desvantagens são tempos de corrida cromatográfica mais longos, maior consumo de solvente e maior contrapressão. Comprimentos de coluna mais curtos minimizam todas essas variáveis, mas também reduzem o poder de separação mecânica, conforme mostrado na Figura N.

Para uma determinada química de partícula, fase móvel e taxa de fluxo, como mostrado na Figura O, uma coluna do mesmo comprimento e diâmetro interno, mas com um tamanho de partícula menor, fornecerá mais poder de separação mecânica ao mesmo tempo. No entanto, sua contrapressão será muito maior.

Poder de separação química – Seletividade

A escolha de uma combinação de química de partículas (fase estacionária) e composição de fase móvel — o sistema de separação — determinará o grau de poder de separação química (como alteramos a velocidade de cada analito). Otimizar a seletividade é o meio mais poderoso de criar uma separação; isso pode evitar a necessidade de força bruta da maior eficiência mecânica possível. Para criar uma separação de quaisquer dois compostos especificados, um cientista pode escolher entre uma multiplicidade de combinações de fase (fase estacionária e fase móvel) e mecanismos de retenção (modos de cromatografia). Eles são discutidos na próxima seção.