Guia para iniciantes em cromatografia líquida

Alumina

Uma forma porosa e particulada de óxido de alumínio [Al₂0₃] utilizada como fase estacionária na cromatografia de adsorção de fase normal. A alumina tem uma superfície básica altamente ativa; o pH de uma pasta aquosa a 10% é de cerca de 10. É sucessivamente lavada com ácido forte para produzir graus neutros e ácidos (pasta de pH 7,5 e 4, respectivamente). A alumina é mais higroscópica do que a sílica. Sua atividade é medida de acordo com a escala de Brockmann† para conteúdo de água; por exemplo, Grau de atividade I contém 1% de H₂O.

†H. Brockmann and H. Schodder, Ber. 74: 73 (1941).

Linha de base*

A parte do cromatograma que registra a resposta do detector quando apenas a fase móvel emerge da coluna.

Cartucho

Um tipo de coluna, sem conexões de extremidade, que consiste simplesmente em um tubo aberto no qual o material de retenção é retido por um frit em cada extremidade. Os cartuchos de SPE podem ser operados em paralelo em um manifold de vácuo. Os cartuchos de HPLC são colocados em um suporte de cartucho que possui conexões de fluido integradas em cada extremidade. As colunas de cartucho são fáceis de trocar, menos caras e mais convenientes do que as colunas convencionais com conexões de extremidade integradas.

Cromatograma*

Uma apresentação gráfica ou outra apresentação da resposta do detector ou outra quantidade utilizada como uma medida da concentração do analito no efluente em relação ao volume ou tempo do efluente. Na cromatografia planar (por exemplo, cromatografia em camada delgada ou cromatografia em papel), o cromatograma pode referir-se ao papel ou à camada que contém as zonas separadas.

Cromatografia*

Um método físico-químico dinâmico de separação no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma das quais é estacionária (a fase estacionária), enquanto a outra (a fase móvel) se move em relação à fase estacionária.

Volume da coluna* (Vc)

O volume geométrico da parte do tubo que contém o preenchimento (área da seção transversal interna do tubo multiplicada pelo comprimento do leito preenchido, L). O volume interpartículas da coluna, também chamado de volume intersticial, é o volume ocupado pela fase móvel entre as partículas no leito preenchido. O volume vazio (V₀) é o volume total ocupado pela fase móvel, ou seja, a soma do volume intersticial e do volume intrapartícula (também chamado de volume de poro).

Detector* (consulte Sensibilidade)

Um dispositivo que indica uma alteração na composição do eluente medindo propriedades físicas ou químicas (por exemplo, absorbância de luz UV/visível, índice de refração diferencial, fluorescência ou condutividade). Se a resposta do detector for linear em relação à concentração da amostra, então, por calibração adequada com padrões, a quantidade de um componente pode ser quantificada. Frequentemente, pode ser benéfico utilizar dois tipos diferentes de detectores em série. Dessa forma, mais informações corroborativas ou específicas podem ser obtidas sobre os analitos da amostra. Alguns detectores (por exemplo, eletroquímicos, de espectrometria de massas) são destrutivos; ou seja, eles realizam uma mudança química nos componentes da amostra. Se um detector desse tipo for emparelhado com um detector não destrutivo, ele geralmente será colocado em segundo lugar no caminho do fluxo.

Visor

Dispositivo que registra a resposta elétrica de um detector na tela de um computador na forma de um cromatograma. Sistemas avançados de registro de dados também realizam cálculos utilizando algoritmos sofisticados, por exemplo, para integrar áreas de pico, subtrair linhas de base, combinar espectros, quantificar componentes e identificar desconhecidos por comparação com bibliotecas padrão.

Eficiência (H, consulte Número da placa, resolução, sensibilidade, velocidade)

Uma medida da capacidade de uma coluna de resistir à dispersão de uma faixa de amostra à medida que ela passa através do leito preenchido. Uma coluna eficiente minimiza a dispersão de faixas ou expansão de faixas. Uma maior eficiência é importante para uma separação eficaz, maior sensibilidade e/ou identificação de componentes semelhantes em uma mistura complexa de amostras.

Os vencedores do Prêmio Nobel, Martin e Synge, por analogia à destilação, introduziram o conceito de altura da placa (H, ou H.E.T.P., altura equivalente a uma placa teórica) como uma medida de eficiência cromatográfica e como um meio de comparar o desempenho da coluna.† Prevendo a tecnologia HPLC e UPLC, eles reconheceram que um leito homogêneo preenchido com o menor tamanho de partícula possível (exigindo maior pressão) era a chave para a eficiência máxima. A relação entre os parâmetros da coluna e do sistema de separação que afetam a expansão de faixas foi descrita posteriormente em uma equação por van Deemter.††

Os cientistas geralmente se referem a uma quantidade que eles podem calcular facilmente e diretamente a partir de medições feitas em um cromatograma, ou seja, o número da placa (N), como eficiência. A altura da placa é então determinada a partir da relação entre o comprimento do leito da coluna e N (H = L/N; os métodos de cálculo de N a partir de um cromatograma são mostrados na Figura U). É importante observar que o cálculo de N ou H utilizando esses métodos está correto apenas para condições isocráticas e não pode ser utilizado para separações de gradiente.

†A.J.P. Martin and R.M. Synge, Biochem. J. 35: 1358–1368 [1941]
††J.J. van Deemter, F. J. Zuiderweg and A. Klinkenberg, Chem. Eng. Sci. 5: 271–289 [1956]

Eluato

A porção do eluente que emerge da saída da coluna contendo analitos em solução. Em HPLC analítica, o eluato é examinado pelo detector para a concentração ou massa de analitos nele. Na HPLC preparativa, o eluato é coletado continuamente em alíquotas em intervalos de tempo ou volume uniformes, ou descontinuamente apenas quando um detector indica a presença de um pico de interesse. Essas frações são posteriormente processadas para obter compostos purificados.

Eluente

A fase móvel (consulte Cromatografia de eluição).

Série eluotrópica

Uma lista de solventes ordenados por força de eluição com referência aos analitos especificados em um sorvente padrão. Essa série é útil ao desenvolver métodos de eluição isocrática e de gradiente. Trappe cunhou esse termo após mostrar que uma sequência de solventes de polaridade crescente poderia separar frações lipídicas na alumina.† Posteriormente, Snyder mediu e tabulou os parâmetros de força do solvente para uma grande lista de solventes em vários sorventes de LC de fase normal.†† Neher criou um nomograma muito útil pelo qual misturas equieluotrópicas (força de eluição constante) de solventes de fase normal poderiam ser escolhidas para otimizar a seletividade de separações por TLC.†††

Uma série eluotrópica típica de fase normal começaria na extremidade fraca com hidrocarbonetos alifáticos não polares, por exemplo, pentano ou hexano, depois progrediria sucessivamente para benzeno (um hidrocarboneto aromático), diclorometano (um hidrocarboneto clorado), éter dietílico, acetato de etila (um éster), acetona (uma cetona) e, finalmente, metanol (um álcool) na extremidade forte (veja a Figura R-1).

†W. Trappe, Biochem. Z. 305: 150 [1940]
††L. R. Snyder, Principles of Adsorption Chromatography, Marcel Dekker [1968], pp. 192–197
†††R. Neher in G.B. Marini-Bettòlo, ed., Thin-Layer Chromatography, Elsevier [1964] pp. 75–86.

Eluir* (verbo)

Cromatografar por cromatografia de eluição. O processo de eluição pode ser interrompido enquanto todos os componentes da amostra ainda estão no leito cromatográfico (cromatografia em camada delgada planar ou papel) ou continuado até que os componentes tenham deixado o leito cromatográfico (cromatografia em coluna).

Observação: O termo eluir é preferível a desenvolver (um termo utilizado em cromatografia planar), para evitar confusão com a prática de desenvolvimento de métodos, em que um sistema de separação (a combinação de fases móveis e estacionárias) é otimizado para uma separação específica.

Cromatografia de eluição*

Um procedimento para separação cromatográfica em que a fase móvel é passada continuamente através do leito cromatográfico. Na HPLC, uma vez que a linha de base do detector tenha se estabilizado e o sistema de separação tenha atingido o equilíbrio, uma porção finita de amostra é introduzida no fluxo de fase móvel em circulação. A eluição continua até que todos os analitos de interesse tenham passado pelo detector.

Força de eluição

Uma medida da afinidade de um solvente em relação à do analito para a fase estacionária. Um solvente fraco não pode deslocar o analito, fazendo com que seja fortemente retido na fase estacionária. Um solvente forte pode deslocar totalmente todas as moléculas de analito e carregá-las através da coluna sem retenção. Para atingir um equilíbrio adequado de separação efetiva e volume de eluição razoável, os solventes são frequentemente misturados para estabelecer uma competição apropriada entre as fases, otimizando assim a seletividade e o tempo de separação para um determinado conjunto de analitos (consulte Seletividade).

O momento dipolo, a constante dielétrica, a ligação de hidrogênio, o tamanho e a forma molecular e a tensão superficial podem fornecer alguma indicação da força de eluição. A força de eluição também é determinada pelo modo de separação. Uma série eluotrópica de solventes pode ser solicitada aumentando a força em uma direção sob condições de adsorção ou fase normal; essa ordem pode ser quase oposta sob condições de partição de fase reversa (consulte a Figura R-1).

Detector de fluorescência

Os detectores de fluorescência excitam uma amostra com um comprimento de onda de luz especificado. Isso faz com que determinados compostos fiquem fluorescentes e emitam luz em um comprimento de onda maior. Um sensor, definido para um comprimento de onda de emissão específico e mascarado para não ser cegado pela fonte de excitação, coleta apenas a luz emitida. Frequentemente, os analitos que não apresentam fluorescência nativa podem ser derivatizados para aproveitar a alta sensibilidade e seletividade dessa forma de detecção, por exemplo, a derivatização de aminoácidos do AccQ•Tag.

Taxa de fluxo*

O volume da fase móvel que passa pela coluna em tempo unitário. Em sistemas HPLC, a taxa de fluxo é definida pelo controlador para o sistema de fornecimento de solvente (bomba). A exatidão da taxa de fluxo pode ser verificada pela coleta e medição sincronizada do efluente na saída da coluna. Como a densidade de um solvente varia com a temperatura, qualquer calibração ou medição de taxa de fluxo deve levar essa variável em consideração. As determinações mais exatas são feitas, quando possível, por peso, não por volume.

A uniformidade (precisão) e a reprodutibilidade da taxa de fluxo são importantes para muitas técnicas de LC, especialmente em separações nas quais os tempos de retenção são essenciais para a identificação do analito, ou na cromatografia de permeação em gel, na qual a calibração e a correlação dos tempos de retenção são essenciais para medições exatas de distribuição do peso molecular de polímeros.

Frequentemente, as condições de separação são comparadas por meio da velocidade linear, não da taxa de fluxo. A velocidade linear é calculada pela divisão da taxa de fluxo pela área da seção transversal da coluna. Enquanto a taxa de fluxo é expressa em volume/tempo (por exemplo, mL/min), a velocidade linear é medida em comprimento/tempo (por exemplo, mm/s).

Cromatografia de permeação em gel*

Separação baseada principalmente em efeitos de exclusão devido a diferenças no tamanho e/ou na forma molecular. A cromatografia de permeação em gel e a cromatografia de filtração de gel descrevem o processo quando a fase estacionária é um gel inchado. Ambas são formas de cromatografia de exclusão por tamanho. Porath e Flodin descreveram pela primeira vez a filtração de gel utilizando géis de dextrano e fases móveis aquosas para a separação com base em tamanho de biomoléculas.† Moore aplicou princípios semelhantes à separação de polímeros orgânicos por tamanho em solução utilizando fases móveis de solvente orgânico em géis de polímero de poliestireno-divinilbenzeno poroso.††

†J. Porath, P. Flodin, Nature 183: 1657–1659 [1959]
††J.C. Moore, U.S. Patent 3,326,875 [filed Jan. 1963; issued June 1967]

Gradiente

A mudança ao longo do tempo nas concentrações relativas de dois (ou mais) componentes de solvente miscíveis que formam uma fase móvel de força de eluição crescente. Um gradiente em etapas é normalmente utilizado na extração em fase sólida; em cada etapa, a composição do eluente é alterada abruptamente de uma fase móvel mais fraca para uma fase móvel mais forte. É ainda possível, secando o leito de sorvente de SPE entre as etapas, mudar de um solvente para outro imiscível.

Um gradiente contínuo é normalmente gerado por um sistema de mistura de baixa ou alta pressão (consulte as Figuras J-2 e J-3) de acordo com uma curva predeterminada (linear ou não linear) que representa a concentração do solvente mais forte B no solvente inicial A durante um período fixo. Uma retenção em uma composição fixa de solvente isocrático pode ser programada em qualquer ponto de tempo dentro de um gradiente contínuo. No final de uma separação, o programa de gradiente também pode ser definido para retornar à composição da fase móvel inicial para reequilibrar a coluna em preparo para a injeção da próxima amostra. Sistemas HPLC sofisticados podem misturar até quatro ou mais solventes (ou misturas de solventes) em um gradiente contínuo.

Injetor (Amostrador automático, Gerenciador de amostras)

Um mecanismo para introduzir (injetar) de forma exata e precisa um volume separado e predeterminado de uma solução de amostra no fluxo de fase móvel em circulação. O injetor pode ser um dispositivo manual simples ou um amostrador automático sofisticado que pode ser programado para injeções autônomas de muitas amostras a partir de um arranjo de vials ou poços individuais em uma sequência predeterminada. Os compartimentos de amostras nesses sistemas podem até ter a temperatura controlada para manter a integridade da amostra durante muitas horas de operação.

A maioria dos injetores modernos incorpora alguma forma de loop de amostras preenchido com seringa que pode ser ligado ou colocado off-line por meio de uma válvula de múltiplas portas. Um sistema de injeção de volume interno mínimo bem projetado está situado o mais próximo possível da entrada da coluna e minimiza o espalhamento da faixa de amostra. Entre injeções de amostra, ele também é capaz de ser lavado para descarte por fase móvel, ou um solvente de lavagem, para evitar o carryover (contaminação da amostra presente por uma anterior).

As amostras são mais bem preparadas para injeção, se possível, dissolvendo-as na fase móvel em que serão injetadas; isso pode evitar problemas com separação e/ou detecção. Caso seja necessário utilizar outro solvente, é desejável que sua força de eluição seja igual ou inferior à da fase móvel. Muitas vezes, é aconselhável misturar um pouco de uma solução de amostra com a fase móvel off-line para testar se há problemas de precipitação ou miscibilidade que possam comprometer uma separação bem-sucedida.

Entrada

A extremidade do leito da coluna onde o fluxo da fase móvel e a amostra entram. Um frit poroso e inerte retém o material de retenção e protege a entrada do leito do sorvente contra contaminação por partículas. As boas práticas de HPLC determinam que as amostras e as fases móveis não devem ter partículas; isso se torna imprescindível para colunas de partículas pequenas, cujas entradas são muito mais fáceis de serem conectadas. Se a entrada do leito da coluna ficar entupida e exibir contrapressão mais alta que o normal, às vezes, inverter a direção do fluxo enquanto direciona o efluente para o descarte pode desalojar e lavar os detritos da amostra que ficam sobre o frit. Se os detritos penetrarem no frit e estiverem alojados na extremidade de entrada do próprio leito, será mais provável que a coluna tenha atingido o fim de sua vida útil.

Cromatografia de troca iônica* (consulte a seção: Separações baseadas na carga)

Esse modo de separação é baseado principalmente nas diferenças nas afinidades de troca iônica dos componentes da amostra. A separação de espécies iônicas principalmente inorgânicas em água ou fases móveis aquosas tamponadas em colunas de troca iônica de partículas pequenas, superficialmente porosas, de alta eficiência, seguida por detecção condutométrica ou eletroquímica, é referida como cromatografia de íons (IC, Ion Chromatography).

Eluição isocrática*

Um procedimento no qual a composição da fase móvel permanece constante durante o processo de eluição.

Cromatografia líquida* (LC, Liquid Chromatography)

Técnica de separação em que a fase móvel é um líquido. A cromatografia líquida pode ser realizada em uma coluna ou em um plano (TLC ou cromatografia em papel). A cromatografia líquida moderna que utiliza partículas menores e pressão de entrada mais alta foi denominada cromatografia líquida de alto desempenho (ou de alta pressão) (HPLC) em 1970. Em 2004, a cromatografia líquida de altíssimo desempenho elevou drasticamente o desempenho da LC para um novo patamar (consulte Tecnologia de UPLC).

Fase móvel* (consulte Eluato, Eluente)

Um fluido que penetra, em uma direção definida, através do comprimento do leito do sorvente de fase estacionária. A fase móvel pode ser um líquido (cromatografia líquida) ou um gás (cromatografia de gás) ou um fluido supercrítico (cromatografia de fluido supercrítico). Em cromatografia gasosa, a expressão "gás de transporte" pode ser utilizada para a fase móvel. Na cromatografia de eluição, a fase móvel também pode ser chamada de eluente, enquanto a palavra eluato é definida como a porção da fase móvel que passou pelo leito do sorvente e contém os compostos de interesse na solução.

Cromatografia de fase normal*

Um procedimento de eluição no qual a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel. Esse termo é utilizado em cromatografia líquida para enfatizar o contraste com a cromatografia de fase reversa.

Pico* (consulte Número de placa)

A parte de um cromatograma diferencial que registra a resposta do detector enquanto um único componente é eluído da coluna. Se a separação estiver incompleta, dois ou mais componentes poderão ser eluídos como um pico não resolvido. Os picos eluídos em condições ideais de uma coluna bem preenchida e eficiente, operada em um sistema que minimiza a expansão de faixas, se aproximam da forma de uma distribuição gaussiana. A quantificação geralmente é feita por meio da medição da área do pico (delimitada pela linha de base e pela curva do pico). Com menos frequência, a altura do pico (a distância medida do ápice do pico até a linha de base) pode ser utilizada para quantificação. Esse procedimento exige que a largura e o formato do pico permaneçam constantes.

Número de placa* (N, consulte Eficiência)

Um número indicativo de desempenho da coluna (poder de separação mecânica ou eficiência, também chamado de contagem de placas ou número de placas teóricas). Relaciona a amplitude da retenção de um pico à sua largura (variação ou distribuição de faixa). Para calcular uma contagem de placas, presume-se que um pico pode ser representado por uma distribuição Gaussiana (uma curva de sino estatística). Nos pontos de inflexão (60,7% da altura do pico), a largura de uma curva gaussiana é duas vezes o desvio padrão (σ) sobre sua média (localizada no ápice do pico). Como mostrado na Figura U, a largura do pico de uma curva gaussiana medida em outras frações da altura do pico pode ser expressa em múltiplos de σ definidos com precisão. A retenção de pico (volume de retenção, V_R ou tempo de retenção, t_R) e a largura do pico devem ser expressas nas mesmas unidades, porque N é um número adimensional. Observe que o método de 5 sigma de cálculo de N é uma medida mais rigorosa da homogeneidade e do desempenho da coluna, pois é mais afetado pela assimetria de pico. As estações de dados do computador podem delinear automaticamente cada pico resolvido e calcular seu número de placa correspondente.

Cromatografia preparativa

O processo de utilização de cromatografia líquida para isolar um composto em uma quantidade e em um nível de pureza suficiente para outros experimentos ou usos. Para processos de purificação farmacêutica ou biotecnológica, colunas de vários pés de diâmetro podem ser utilizadas para vários quilos de material. Para isolar apenas alguns microgramas de um produto natural valioso, uma coluna de HPLC analítica é suficiente. Ambas são abordagens cromatográficas preparativas, diferindo apenas na escala (consulte a seção sobre Escala de HPLC e a Tabela A).

Resolução* (Rs, consulte Seletividade)

A separação de dois picos, expressa como a diferença em seus respectivos períodos de retenção, dividida pela largura de pico média na linha de base. R_s = 1,25 indica que dois picos de largura igual estão apenas separados na linha de base. Quando R_s = 0,6, a única indicação visual da presença de dois picos em um cromatograma é um pequeno entalhe perto do ápice do pico. Colunas de maior eficiência produzem picos mais estreitos e melhoram a resolução para separações difíceis; no entanto, a resolução aumenta apenas pela raiz quadrada de N. O método mais poderoso para aumentar a resolução é aumentar a seletividade alterando a combinação de fase móvel/estacionária utilizada para a separação cromatográfica (consulte a seção sobre Poder de separação química).

Fator de retenção* (k)

Uma medida do tempo em que o componente da amostra reside na fase estacionária em relação ao tempo em que ele reside na fase móvel; ela expressa quanto tempo mais um componente da amostra é retardado pela fase estacionária do que levaria para se deslocar através da coluna com a velocidade da fase móvel. Matematicamente, é a relação entre o tempo de retenção ajustado (volume) e o tempo de retenção (volume): k = t_R'/t_M (consulte Tempo de retenção e seletividade).

Observação: No passado, este termo também era expresso como coeficiente de partição, razão de capacidade, fator de capacidade ou razão de distribuição de massa, e simbolizado por k'.

Tempo de retenção* (tR)

O tempo entre o início da eluição (normalmente, em HPLC, o momento da injeção ou introdução da amostra) e o surgimento do pico máximo. O tempo de retenção ajustado, _R’, é calculado subtraindo de t_R o tempo de retenção (t_M, o tempo desde a injeção até a eluição do pico máximo de um analito totalmente não retido).

Cromatografia de fase reversa*

Um procedimento de eluição utilizado em cromatografia líquida em que a fase móvel é significativamente mais polar do que a fase estacionária, por ex., um material microporoso à base de sílica com cadeias de alquila quimicamente ligadas à sua superfície acessível. Observação: Evite utilizar o termo incorreto fase reversa. (Consulte a Referência 4 para ver algumas ideias novas sobre o mecanismo de separações de fase reversa.)

Seletividade (Fator de separação, σ)

Um termo utilizado para descrever a amplitude da diferença entre as afinidades termodinâmicas relativas de um par de analitos para as fases móvel e estacionária especificadas que compreendem o sistema de separação. O termo adequado é fator de separação (σ). É igual à razão de fatores de retenção, k2/k1 (consulte Fator de retenção); por definição, σ é sempre ≥ 1. Se σ = 1, então ambos os picos coeluem, e nenhuma separação é obtida. Na cromatografia preparativa, é importante maximizar α para obter a maior capacidade de carga e rendimento da amostra. (consulte a seção sobre Poder de separação química)

Sensibilidade* (S)

A saída de sinal por unidade de concentração ou unidade de massa de uma substância na fase móvel que entra no detector, por exemplo, a inclinação de uma curva de calibração linear (consulte Detector). Para detectores sensíveis à concentração (por exemplo, absorbância UV/VIS), a sensibilidade é a relação entre a altura do pico e a concentração do analito no pico. Para detectores sensíveis ao fluxo de massa, é a relação entre a altura do pico e a massa unitária. Se a sensibilidade for uma característica de desempenho exclusiva, ela deverá depender apenas do processo de medição química, não de fatores de escala.

A capacidade de detectar (qualificar) ou medir (quantificar) um analito é governada por muitos fatores químicos e de equipamentos. Picos bem resolvidos (seletividade máxima) eluindo de colunas de alta eficiência (largura de pico estreita com boa simetria para altura máxima do pico), bem como boa sensibilidade e especificidade do detector são ideais. A interferência do sistema de separação e o ruído do componente eletrônico também devem ser minimizados para atingir a sensibilidade máxima.

Extração em fase sólida (SPE, Solid-Phase Extraction)

Uma técnica de preparo de amostras que utiliza princípios de LC para isolar, enriquecer e/ou purificar analitos a partir de uma matriz complexa aplicada a um leito cromatográfico em miniatura. A SPE off-line é feita (manualmente ou por meio de automação) com partículas maiores em cartuchos de plástico individuais ou em poços de placa de microeluição, utilizando baixa pressão positiva ou vácuo para auxiliar o fluxo. A SPE on-line é feita com partículas menores em colunas de HPLC em miniatura utilizando pressões mais altas e uma válvula para alternar a coluna de SPE on-line com a coluna de HPLC primária ou off-line para descarte, conforme apropriado.

Os métodos de SPE utilizam gradientes em etapas (consulte Gradiente) para realizar as etapas de condicionamento do leito, carregamento de amostras, lavagem e eluição. As amostras são carregadas normalmente em condições em que o k de analitos importantes é o mais alto possível, de modo que elas sejam totalmente retidas durante as etapas de carregamento e lavagem. A eluição é feita trocando para uma mistura de solvente muito mais forte (consulte Força de eluição). O objetivo é remover as interferências da matriz e isolar o analito em uma solução e em uma concentração adequada para análise subsequente.

Velocidade (consulte Eficiência, Taxa de fluxo, Resolução)

Um benefício de operar separações por LC em velocidades lineares mais altas utilizando colunas analíticas de menor volume e partículas menores ou colunas preparativas de maior volume e partículas maiores. Avanços de ordem de magnitude na velocidade da LC surgiram em 1972 (com a utilização de partículas de 10 μm e bombas capazes de fornecer fluxo de fase móvel exato a 6000 psi), em 1976 (com colunas preparativas de 75 μm operadas a uma taxa de fluxo de 500 mL/min) e, em 2004, (com a introdução da tecnologia UPLC – colunas de partículas de 1,7 μm operadas a 15000 psi).†

Os sistemas LC analíticos de alta velocidade não devem apenas acomodar pressões mais altas em todo o sistema de fluidos; o tempo de ciclo do injetor deve ser curto; os misturadores de gradiente devem ser capazes de realizar um retorno rápido entre amostras; os sensores do detector devem responder rapidamente a pequenas alterações na composição do eluato; e os sistemas de dados devem coletar as dezenas de pontos a cada segundo necessários para representar em gráfico e quantificar picos estreitos com precisão.

Juntas, maior resolução, maior velocidade e maior eficiência normalmente proporcionam maior rendimento. Mais amostras podem ser analisadas em um dia de trabalho. Quantidades maiores de composto podem ser purificadas por corrida ou por período de processo.

Fase estacionária*

Uma das duas fases que formam um sistema cromatográfico. Pode ser um sólido, um gel ou um líquido. Se for um líquido, pode ser distribuído em um sólido. Esse sólido pode ou não contribuir para o processo de separação. O líquido também pode ser quimicamente ligado ao sólido (fase ligada) ou imobilizado nele (fase imobilizada).

As expressões leito cromatográfico ou sorvente podem ser aplicadas como um termo geral para denotar qualquer uma das diferentes formas em que a fase estacionária é utilizada.

A utilização do termo fase líquida para denotar a fase móvel em LC não é recomendada. Isso evita confusão com a cromatografia a gás, em que a fase estacionária é chamada de fase líquida (na maioria das vezes, um líquido revestido em um suporte sólido).

A cromatografia de partição líquida-líquida em coluna aberta (LLC, Liquid-Liquid Chromatography) não foi bem convertida em HPLC. Ela foi suplantada pela utilização de preenchimentos de fase ligada. A LLC provou ser incompatível com os detectores modernos devido a problemas com o sangramento do revestimento líquido da fase estacionária para fora de seu suporte sólido, contaminando, assim, a fase móvel do líquido imiscível.

Tecnologia UPLC

A utilização de um sistema LC de alta eficiência projetado holisticamente para acomodar partículas inferiores 2 μm e pressão de operação muito alta é denominada cromatografia líquida de altíssimo desempenho (tecnologia UPLC).† Os principais benefícios dessa tecnologia são melhorias significativas na resolução em relação à HPLC e/ou tempos de corrida mais rápidos, mantendo a resolução vista em uma separação por HPLC existente.

†Para obter mais informações, acesse: https://www.waters.com/uplc