Enfoques prácticos para el aislamiento de péptidos

Si bien por lo general el aislamiento tradicional de péptidos se realiza mediante detección UV, el aislamiento dirigido por masas facilita el proceso de purificación con una discriminación menos ambigua entre el péptido objetivo y los contaminantes formados durante la síntesis y la escisión. La detección de masas se puede utilizar para evaluar la identidad y la homogeneidad de los picos en cromatogramas complejos y aumenta el rendimiento de las muestras. Desarrollar una separación que abarque tanto la detección de masa como la de UV garantiza un perfil cromatográfico de la muestra más completo. Los compuestos que no se ionizan, o que se ionizan de manera defectuosa, a menudo se detectarán con UV de longitud de onda baja. Por el contrario, los péptidos con una extinción de UV muy baja suelen detectarse fácilmente con MS.

Eluyentes

Los eluyentes que se utilizan habitualmente en el aislamiento de péptidos, incluidos el acetonitrilo, el metanol, el etanol y el isopropanol, son compatibles con la ionización por electrospray (ESI) y otras técnicas de ionización atmosférica. Sin embargo, por lo general, el acetonitrilo proporciona la mejor resolución, selectividad, simetría de picos y eficacia. La menor viscosidad del acetonitrilo también reduce la contrapresión del sistema de LC cuando se utiliza para aislamientos cromatográficos. Tanto la volatilidad como la capacidad del eluyente para donar protones son importantes para la ESI. Los eluyentes orgánicos volátiles reducen la tensión superficial de las gotas formadas en la fuente de MS, lo que favorece una mejor ionización y una mayor sensibilidad. Muchos péptidos se analizan y aíslan utilizando modificadores ácidos, como el ácido fórmico o el ácido trifluoroacético, aunque el TFA suprime la ionización hasta cierto punto. Si se requiere un cambio de positivo a negativo para el desarrollo de métodos, las fases móviles de acetato amónico o formiato amónico son opciones aceptables para MS. Para los péptidos que se separan mejor a un pH alto, son adecuadas las fases móviles preparadas con bicarbonato amónico. Para reducir la posibilidad de precipitación en el detector de masas, se deben utilizar soluciones tampón volátiles a concentraciones de 20 mM o menos.

Gestión de la detección

Se deben tener en cuenta consideraciones especiales para la detección en la cromatografía preparativa. Los picos altamente concentrados superan el intervalo lineal de la mayoría de los detectores y los caudales altos no son compatibles con el hardware del detector. Algunos detectores, como MS y ELSD, son destructivos. Por lo tanto, es necesario reducir eficazmente el flujo y la concentración que llegan a los detectores, y reducir al mismo tiempo el gasto de muestra. Se suele utilizar un divisor de caudal pasivo para dividir y diluir la muestra antes de que llegue a los detectores (figuras 47 y 48). Un eluyente complementario diluye el muestreo del flujo de preparación y lo transfiere a los detectores.

Los divisores pasivos están fabricados para utilizarse con un intervalo de caudal cromatográfico y una relación de división determinados. El sistema de fluidos del divisor debe coincidir con el caudal adecuado para la columna seleccionada. Se utilizan proporciones de división más altas cuando los picos eluyen a una concentración más alta. Los divisores de caudal más utilizados y sus relaciones de división se muestran en la tabla 6.

Tabla 6. Divisores pasivos disponibles en Waters.

Como alternativa a la división de caudal pasiva, un divisor activo muestrea mecánicamente el flujo de preparación a una velocidad proporcional a la proporción de división programada. A continuación, el flujo muestreado se diluye y el eluyente complementario lo lleva a los detectores. Sin embargo, los divisores activos a menudo alteran la línea de base y, además, el desgaste mecánico compromete con frecuencia el rendimiento. Tanto los divisores de caudal pasivos como los activos son igualmente efectivos para muestrear el flujo de preparación, por lo que el tipo de divisor empleado dependerá de las preferencias del usuario.

Modificadores

Las fases móviles y los modificadores específicos se eligen a partir del uso previsto del péptido que se esté aislando. Como se comentó con anterioridad, el modificador de fase móvil es un aditivo que controla el carácter iónico del péptido aumentando o disminuyendo el pH. También puede aumentar la hidrofobia de la muestra formando pares de iones con las cadenas laterales cargadas del péptido y sus extremos terminales. El ácido trifluoroacético se utiliza habitualmente con este objetivo.

El par iónico aumenta la interacción del péptido con la fase estacionaria de la columna hidrófoba y, en consecuencia, la calidad de la separación suele mejorar. Desafortunadamente, los pares iónicos fuertes formados con TFA no se pueden separar fácilmente en las condiciones utilizadas en la ionización por electrospray. Como resultado, se ionizan menos moléculas de péptidos y se reduce la intensidad de la señal. Idealmente, el modificador más adecuado sería uno que forme pares iónicos para mejorar la separación cromatográfica, pero que no impida la ionización por electrospray.

Apffel, et al. propusieron la adición poscolumna de un ácido débil que competiría con el TFA para emparejarse con el analito. Con un ácido débil a una concentración lo suficientemente alta como para impulsar la competencia para favorecer la protonación del TFA, el TFA protonado se puede evaporar y el analito se puede ionizar de manera más eficiente. La sensibilidad y la intensidad de la señal de MS aumentan. Aunque se pueden utilizar muchos ácidos diferentes en diferentes concentraciones para este fin, se ha utilizado con éxito ácido propiónico al 0,1 % en agua/orgánico 1:1 como eluyente complementario en la purificación dirigida por masas.

Masa monoisotópica frente a masa media

Si bien la purificación dirigida por masas reduce la ambigüedad en el aislamiento de los péptidos objetivo, es importante considerar qué masas deben utilizarse para la activación de fracciones. Para la mayoría de los aislamientos de moléculas pequeñas, la masa monoisotópica es la masa principal utilizada para la identificación, mientras que otros aductos de iones relacionados se definen y controlan en función de este valor. Para moléculas más grandes, como los péptidos, a veces se utiliza la masa media como identificador principal.

La masa monoisotópica se calcula utilizando la masa de los isótopos más abundantes de cada elemento en la molécula, mientras que la masa media se calcula utilizando la media ponderada de todos los isótopos de cada elemento presentes de forma natural en la molécula. En consecuencia, para los péptidos, la masa media puede ser notablemente mayor que la masa monoisotópica. A medida que aumenta el número de carbonos en la molécula, existe una mayor probabilidad de que haya más 13_C presente, lo que, a su vez, aumentará el peso molecular.

Además, la masa monoisotópica puede no ser el pico más abundante en el espectro de masas. Si bien no existe una regla para definir cuándo usar la masa monoisotópica o la masa media, el intervalo de peso molecular 1500-1700 es generalmente el punto de cruce para pasar al uso de la masa media para la activación de péptidos. En la práctica, muchos programas de software disponibles calculan tanto el valor de m/z medio como el monoisotópico para los estados de carga del péptido. Es más prudente incluir ambas alternativas como activadores. Las mejores opciones para la activación se harán evidentes durante el análisis de screening antes del aislamiento.

Estados de carga

El electrospray, una técnica que ioniza las muestras en condiciones moderadas y genera moléculas con múltiples cargas, se utiliza con frecuencia en la purificación dirigida por masas. Aunque algunos péptidos pueden tener pesos moleculares superiores al límite de masa superior del analizador, los iones multicargados con valores de m/z más bajos suelen estar dentro del intervalo de masas del espectrómetro. Varios factores influyen en el estado de la carga de los péptidos, incluido el pH de la solución, el número de grupos funcionales ácidos y básicos y las propiedades físicas del eluyente utilizado en el análisis.

Como se mencionó con anterioridad, el proceso de aislamiento de péptidos generalmente comienza con el análisis. Se calcula el peso molecular y los posibles estados de carga, lo que facilita la identificación del producto peptídico. Si bien el perfil de la muestra bruta revela el grado de desarrollo del método necesario para mejorar la resolución que llevará al aislamiento del producto puro, el análisis también revela información sobre los estados de carga. Se debe tener en cuenta el espectro de masas derivado del cromatograma analítico de iones totales brutos que se muestra en la figura 49. La masa del péptido calculada fue 1772,9 y el ion cargado positivamente (1773,9) está presente, aunque en una cantidad muy pequeña. El ion doblemente cargado en 887,8 es, con mucho, el ion presente en mayor abundancia. También hay una pequeña cantidad de ion triplemente cargado (592,3) y una impureza (781,2) en cantidades menores. A pesar de la presencia de iones multicargados en el espectro de masas, el péptido se muestra como un solo pico en el cromatograma. Es previsible que los picos con carga doble y triple se eluyan al mismo tiempo en los cromatogramas de iones extraídos (figura 50).

Activadores de recolección de fracciones

La carga múltiple de péptidos a menudo dificulta la predicción de las especies más abundantes en un experimento de MS determinado. Por lo tanto, los activadores de fracciones para el aislamiento de péptidos mediante la purificación dirigida por masas deben incluir todos los iones multicargados esperados.

Recopilación de datos: continuos frente a centroides

Debido a la complejidad de las muestras de péptidos, la probabilidad de múltiples estados de carga y las alternativas para usar la masa monoisotópica o media a medida que aumenta la longitud del péptido, los datos de MS deben recopilarse en modo continuo. Los datos continuos muestran la intensidad observada de todos los puntos resueltos en el eje de masa. Incluye la imprecisión estadística en la medición del valor de m/z de una intensidad específica. Esta señal original se puede procesar para obtener la intensidad de cada una de las posibles señales de masa superpuestas. Esto permite la discriminación de valores m/z muy similares. Los datos centroides son datos continuos procesados para mostrar un solo punto de datos centrado para cada distribución de iones en un espectro de masas y se muestran como barras en el espectro de masas (figura 51).

Ejemplos de aislamiento de péptidos dirigido por masas

Los siguientes dos péptidos, proporcionados por el Dr. Kelly Wasmund de Research Genetics, Inc. (Huntsville, AL, EE. UU.), se aislaron mediante purificación dirigida por masas utilizando los principios comentados:

• NH2-ISQAVHAAHAEINEAGR-COOH (abreviado como ISQA)
• NH2-SIINFEKL-COOH (abreviado como SIIN)

Cada péptido se humedeció individualmente en 0,5 mL de dimetilformamida (DMF) y después se diluyó hasta 5,0 mL con agua. La concentración de ISQA se estimó en 5-10 mg/mL y SIIN se estimó en 10 mg/mL. Las condiciones para las separaciones a pequeña escala de cada uno de los péptidos se indican en la tabla 7; los resultados cromatográficos y espectrales se presentan en las figuras 52 y 53, respectivamente. Los iones objetivo calculados para los diversos estados de carga de ISQA y SIIN se muestran en la tabla 8.

Pequeña escala
Eluyente A: TFA al 0,1 % en agua
Eluyente B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo
Vol. inyección: 40 µL
Columna: 4,6 x 50 mm Simetría 300, C_18, 5 µm

Gran escala
Eluyente A: TFA al 0,1 % en agua Eluyente B: TFA al 0,1 % en acetonitrilo
Vol. inyección: 5 mL
Columna: 30 x 150 mm Simetría 300, C_18, 7 µm
Masas objetivo: (ISQA) [M+H]+ = 1773,9, [M+2H]2+ = 887,5, [M+3H]3+ = 592,2, [M+4H]4+ = 447,2
Masas objetivo: (SIIN) [M+H]+ = 963,5, [M+2H]2+ = 482,3, [M+3H]3+ = 321,9

Tabla 7. Condiciones de gradiente utilizadas en las separaciones a pequeña escala de ISQA y SIIN.

Tabla 8. Iones objetivo calculados para los diversos estados de carga de ISQA y SIIN.

Entender las curvas de Van Deemter

Los gradientes focalizados para cada uno de los péptidos se diseñaron para mejorar la resolución entre el péptido objetivo y los contaminantes que eluyen muy cerca. El gradiente focalizado preparativo para ISQA se inició en el 12 %B y se extendió hasta el 20 %B, con elución del péptido cerca del 17 %B (tabla 9 y figura 54). De manera similar, el gradiente focalizado preparativo para SIIN varió de 23 %-31 %B, con elución de producto cerca del 28 %B (tabla 10 y figura 55). Los activadores de masa para la recolección de fracciones incluían los iones multicargados esperados (tabla 8).

Entender las curvas de Van Deemter

Tabla 9. Gradiente de preparación focalizado utilizado para la purificación de ISQA.

Tabla 10. Gradiente de preparación focalizado utilizado para la purificación de SIIN.

Se analizaron las fracciones resultantes de los análisis preparativos para evaluar la pureza. Se utilizaron varios canales de detección para monitorizar el análisis y proporcionar una caracterización completa de las fracciones. El análisis de fracciones de los péptidos ISQA y SIIN se realizó con el mismo método de gradiente utilizado para el análisis de péptidos brutos. Se muestran los resultados para ISQA y SIIN en las figuras 56 y 57, respectivamente.

Conclusión

Los péptidos continúan ocupando un nicho importante en el campo de las terapias con tecnologías nuevas y mejoradas para la síntesis, el diseño, el descubrimiento y desarrollo y la fabricación de fármacos. A pesar de los cambios en la tecnología, los principios fundamentales del aislamiento de péptidos permanecen constantes y muchos procesos dependen de la HPLC en fase reversa junto con la detección UV y de masas. Analizar el péptido bruto utilizando un gradiente rápido, enfocar el gradiente y escalar geométricamente a una columna más grande con la dilución en columna y el control de la temperatura son métodos eficaces para aislar rápidamente los péptidos objetivo. Aunque la detección UV se utiliza ampliamente en el aislamiento de péptidos, la purificación dirigida por masas reduce el número de fracciones recogidas y el tiempo necesario para el análisis de fracciones posterior. La gestión de la señal del detector mediante el uso de tecnología de división y dilución, el uso de fases móviles cromatográficas, modificadores y eluyentes complementarios adecuados, y la selección de estados de carga razonables para la activación de fracciones simplifican el protocolo de purificación de péptidos.