Guía de iniciación a la SFC preparativa

Consideraciones sobre el método analítico

Cuando se va a escalar un método analítico con fines de purificación, es importante que la cromatografía sea la mejor posible para la aplicación. Una mejor resolución a escala analítica significa una mejor cromatografía en la escala preparativa, lo que da como resultado un mayor rendimiento y fracciones más puras. Los métodos analíticos también deben tener en cuenta las condiciones de la técnica preparativa, como el calentamiento de la columna, el modo de inyección, las caídas de presión, la presión del sistema y las columnas correspondientes. Si la purificación se realiza mediante MS (espectrometría de masas), todo el screening y el desarrollo de métodos a escala analítica también deben realizarse mediante la detección por MS. Para los métodos de gradiente, la pendiente del gradiente y el tiempo de equilibrado deben tener en cuenta la diferencia de volumen entre los sistemas analítico y preparativo. El efecto del diluyente también debe tenerse en cuenta, ya que muchas veces la carga analítica se realiza mediante inyecciones de flujo mixto, mientras que el método preparativo utiliza inyecciones de flujo modificador.

Capacidad de carga

Teniendo en cuenta la diferencia en las estrategias de inyección, los estudios de carga se suelen realizar primero en la escala más pequeña (analítica). Es importante conocer la solubilidad de los compuestos en una muestra antes de introducirla en el sistema. La mejor práctica en las aplicaciones preparativas es poder cargar la mayor cantidad de muestra en la menor cantidad de eluyente (muestras altamente concentradas). Sin embargo, la muestra también debe permanecer en solución después de introducirse en la fase móvil orgánica y de CO₂ combinada. Una vez que se ha determinado una concentración aceptable, se lleva a cabo un estudio de carga de muestra en el que el volumen de inyección se aumenta gradualmente hasta que se pierde la resolución o la cromatografía ya no se puede utilizar para obtener fracciones puras de los compuestos de interés.

Requisitos generales para un escalado correcto

Una vez que se ha desarrollado un método aceptable y se ha completado un estudio de carga a escala analítica, lo ideal es que la retención y la selectividad sean iguales (o similares) en el escalado. Para escalar correctamente la cromatografía, es necesario que varios parámetros permanezcan constantes:

■ Las fases móviles deben ser idénticas; en SFC, esto significa un coeluyente idéntico (eluyente B) y que el CO₂ tenga calidad, presión de entrada, estado físico (líquido o gas) y método de suministro similares.

■ Las columnas deben tener la misma composición química, longitud y tamaño de partícula para proporcionar la mejor oportunidad de hacer coincidir la cromatografía a diferentes escalas. Si se utilizan columnas de tamaño de partícula pequeño en la escala analítica, la relación entre la longitud y el tamaño de partícula (L/dp) debe ser la misma entre las columnas.

■ Las muestras deben tener la misma concentración y estar disueltas en el mismo diluyente.

Escalado geométrico

En la SFC preparativa, al igual que en LC (cromatografía líquida), los volúmenes de inyección (carga) y los caudales se escalan geométricamente.

Para mantener la forma de los picos y la capacidad de carga, es necesario escalar el volumen de inyección de forma adecuada para el tamaño de la columna. La capacidad se determina mediante la siguiente ecuación:

donde Vol es el volumen de inyección (µL), D es el diámetro interno de la columna (mm) y L es la longitud de la columna (mm).

Del mismo modo, para mantener la calidad de la separación, el caudal se escala en función de las dimensiones de la columna. Con columnas de idéntica longitud y tamaño de partícula, el escalado geométrico del caudal es la siguiente:

donde F es el caudal (mL/min) y D es el diámetro interno de la columna (mm).

Volumen de permanencia y volumen extracolumna

Cuando las columnas tienen la misma longitud, se requieren cambios en el perfil de gradiente en el método preparativo en función del volumen de permanencia. Para realizar estos ajustes, se debe medir el volumen de permanencia tanto para el sistema analítico como para el preparativo. Para determinar el volumen de permanencia, normalmente se añade al coeluyente un compuesto o eluyente que proporciona una señal UV y se analiza un gradiente sin una columna. Basándose en el tiempo de retardo entre el inicio del gradiente en las bombas y el cambio de señal en el detector, el volumen de permanencia se puede determinar multiplicando el tiempo de retardo por el caudal (figura 25).

También es importante tener en cuenta el impacto de cualquier volumen extracolumna, como los tubos, las válvulas de inyección, el tamaño del loop, las celdas de flujo del detector y los divisores, que pueden provocar el ensanchamiento de banda en la cromatografía final. Para medir el volumen adicional de la columna y el ensanchamiento de banda, se extrae la columna y se realiza una inyección. El tiempo entre la inyección y la detección, multiplicado por el caudal, es igual al volumen extracolumna. La forma del pico sin columna indica cualquier ensanchamiento que se produce como resultado del volumen extracolumna. Debido a que el sistema se conectó para la inyección con corriente de modificador, la inyección se realizó con un 100 % de coeluyente, por lo que el volumen se pudo determinar con mayor exactitud y sin la adición de CO₂ después de la inyección. Los detalles sobre este procedimiento se incluyen en Preparative OBD Column Calculator (Calculadora de columnas OBD preparativa), una aplicación online a la que se puede acceder en www.waters.com. La calculadora de columnas proporciona una herramienta fácil de usar que ayuda en todos los cálculos de escalado analíticos a preparativos.

Consideraciones sobre la densidad de la fase móvil

Las reglas simples de escalado ascendente para LC, aunque son aplicables en SFC, no se pueden aplicar directamente, ya que suponen una densidad constante de la fase móvil. El escalado en SFC es más complejo, principalmente debido a la compresibilidad de la fase móvil que causa variaciones de densidad, presión y temperatura en la columna y entre sistemas. Las variaciones en estos factores tienen un impacto en la composición y la fuerza de la fase móvil. Los efectos resultantes sobre la retención y la selectividad hacen que sea más difícil mantener el perfil de separación entre los sistemas de escalado analíticos y preparativos.

Las variaciones de densidad y temperatura no se pueden controlar directamente, pero la cromatografía se puede comparar correctamente en varias escalas ajustando los siguientes parámetros del método en SFC:

■ Igualar la presión promedio (y por lo tanto la densidad media) entre sistemas. La presión media es igual a la suma de las presiones frontal y posterior dividida por dos. Las presiones se pueden igualar cambiando la configuración del regulador de presión automatizado en los instrumentos analíticos o preparativos para mantener perfiles de presión (densidad) similares en toda la columna. Cabe señalar que la coincidencia de la presión media no siempre asegurará un perfil de densidad coincidente; sin embargo, los perfiles mostrarán una mejor coincidencia.

■ Igualación precisa de la composición de la fase móvil de dióxido de carbono y coeluyente. Esto es básicamente una conversión de unidades entre sistemas de flujo volumétrico a flujo másico (en sistema analítico) o de flujo másico a flujo volumétrico (en sistema preparativo) para tener fases móviles equivalentes.

En SFC, la composición del coeluyente es el parámetro más importante que controla la retención de picos. Como resultado, el escalado exacto de la composición de los coeluyentes es esencial para el escalado del método. Al igualar el flujo másico y la composición del CO₂ y el coeluyente con la presión y la temperatura de salida de la columna, es posible un escalado fiable desde un instrumento basado en flujo volumétrico a un instrumento basado en flujo másico.

Ejemplo de escalado

En este ejemplo, el método analítico se desarrolló en el sistema UPC² con los siguientes parámetros (tabla 6).

Para mantener constantes la longitud de la columna y el tamaño de partícula, se utilizó una columna Chiralpak IA de 21x150 mm con partículas de 5 µm en el sistema preparativo. El volumen de inyección se escaló geométricamente, por lo que la inyección de 10 µL en la columna de diámetro interno de 4,6 mm equivalía a una inyección de 208 µL en la columna de 21 mm de diámetro interno. En este caso, se controló el flujo volumétrico de la bomba de CO₂ del sistema analítico, mientras que la bomba del sistema preparativo se controló el flujo másico. Como resultado, el caudal de CO₂ del método analítico tuvo que convertirse en flujo másico antes de calcular el escalado geométrico. Esto se hizo utilizando la siguiente ecuación.

■ Flujo de CO₂ = 2,67 mL/min

■ Densidad de CO₂ = 0,89 g/mL

■ Flujo de CO₂ (masa) = flujo de CO₂ × densidad de CO₂

■ Flujo de CO₂ (masa) = 0,89 × 2,67 = 2,38 g/min

Debido a que el coeluyente escala normalmente (mL a mL) y el caudal del coeluyente fue de 0,33 mL/min, el caudal analítico total fue de 2,70 g/min a aproximadamente un 12 % de metanol. Este caudal y porcentaje se escalaron geométricamente, lo que dio como resultado un caudal preparativo de 56 g/min en la columna de 21 × 150 mm en condiciones de coeluyente del 12 %.

Una vez determinados el flujo y la composición, el perfil de densidad tenía que coincidir con el sistema analítico utilizando la misma presión media. La presión frontal en el sistema analítico fue de 162 bar y la contrapresión fue de 120 bar (la caída de presión fue de 42 bar), por lo que se calculó que la presión media era de 141 bar. Debido a que la caída de presión en el sistema preparativo fue de solo 24 bar, la contrapresión tuvo que establecerse en 130 bar para igualar la presión media del sistema analítico. Por último, la temperatura también se ajustó a 35 °C. Con estos parámetros, en la figura 26 se muestra el escalado satisfactorio de la separación del sistema ACQUITY UPC² al sistema de SFC preparativa (Prep SFC). Los perfiles son iguales; sin embargo, hay un ligero aumento en la retención en el sistema preparativo, probablemente debido a la diferencia en la estrategia de inyección. El sistema analítico utilizó la inyección de flujo mixto, mientras que el sistema preparativo utilizó la inyección de flujo modificador.

Inyecciones apiladas

Para muchas aplicaciones, se utilizan inyecciones apiladas. Las inyecciones apiladas reducen el tiempo entre los ciclos de inyección y minimizan el uso de eluyentes. Las inyecciones apiladas también mejoran significativamente el rendimiento al utilizar todo el espacio cromatográfico disponible para la separación y purificación continuas. Por lo general, las inyecciones se realizan mientras hay una muestra ya inyectada en la columna (o eluyendo de ella). Por lo tanto, para utilizar inyecciones apiladas, se requieren métodos isocráticos. Para apilar las inyecciones correctamente, es necesario determinar el tiempo correcto del ciclo (o el tiempo entre inyecciones). Además, se requiere el tiempo de análisis total para la última inyección de la secuencia para garantizar que se eluyan y recojan todos los conjuntos de picos. La figura 27 muestra cómo se determinan estos valores y, a continuación, se aplican en un conjunto de inyecciones apiladas. Debido a que el tiempo del ciclo es aproximadamente la mitad del tiempo de análisis total, se realizan dos inyecciones antes de que el primer pico objetivo comience a eluir. Después de realizar la última inyección, se eluyen y se recogen dos conjuntos de picos. En este caso, el uso de inyecciones apiladas reduce el tiempo total de procesamiento a la mitad en comparación con los análisis de inyección única convencionales.

Ejemplo Aplicaciones

Debido al intervalo de selectividad ampliado de SFC descrito anteriormente, la técnica es adecuada para una amplia variedad de aplicaciones (tabla 7).

Tabla 7. Aplicaciones preparativas de SFC por segmento de mercado.

Independientemente del segmento de mercado o el objetivo de la purificación, la SFC preparativa proporciona:

■ Selectividad diversa en una única plataforma fácil de usar

■ Intervalo de escalado cromatográfico

■ Mayor productividad y ahorro de eluyentes

■ Ortogonalidad a LC de fase reversa

■ Separación y purificación de compuestos con similitud estructural

En esta sección, se presentan extractos de aplicaciones de ejemplo para mostrar diferentes flujos de trabajo y áreas de aplicación. Todas estas aplicaciones se pueden ver en su totalidad en el sitio web de Waters, www.waters.com.

Purificación quiral de fragancias y aromas volátiles mediante SFC

Una de las áreas de aplicación clave de SFC son las separaciones quirales. Así como los enantiómeros de los fármacos quirales exhiben una actividad farmacológica diferente, la estereoquímica de los compuestos de aroma y fragancia determina el sabor, la calidad del olor y la intensidad. La purificación de estos compuestos puede ser un desafío debido a su volatilidad. La SFC ofrece una opción rápida a baja temperatura para una alta recuperación de compuestos de aroma y fragancia quirales.

En este caso, los enantiómeros de linalool y terpinen-4-ol se purificaron a partir de aceites esenciales de lavanda y árbol del té, respectivamente, utilizando SFC preparativa quiral con inyecciones apiladas. La figura 28 muestra el escalado de los métodos analíticos en la columna AD-H de 4,6 × 250 mm a la columna AD-H de 10 × 250 mm semipreparativa. La separación del aceite del árbol del té muestra la presencia de ambos enantiómeros de terpinen-4-ol, mientras que el aceite de lavanda contiene solo uno de los enantiómeros de linalool. Los parámetros del método SFC preparativa se muestran en la tabla 8.

Los métodos eran isocráticos, por lo que se utilizaron inyecciones apiladas para maximizar la eficacia de recogida. Basándose en la cromatografía, el tiempo del ciclo fue de aproximadamente 3 minutos para el aceite de árbol de té y de 2 minutos para el aceite de lavanda. La purificación quiral resultante utilizando inyecciones apiladas se muestra en la figura 29, en la que se procesaron 50 mg de aceite de árbol de té en menos de 40 minutos y 30 mg de aceite de lavanda en menos de 30 minutos.

El análisis de fracciones se muestra en la figura 30, donde la pureza de las tres fracciones era superior al 92 %. Los estudios de recuperación se realizaron utilizando patrones racémicos de terpinen-4-ol y linalool, lo que dio como resultado una recuperación del 70 % al 80 %, lo cual fue notable dadas las recuperaciones bastante bajas que se obtienen normalmente.

Purificación aquiral de un compuesto farmacéutico mediante activación de fracciones basada en MS

Con la purificación dirigida por UV, los detectores no pueden distinguir los picos entre sí. Muchos compuestos absorben a la misma longitud de onda. La purificación dirigida por masas recoge fracciones en función de la masa, que es un parámetro mucho más específico porque distingue entre el compuesto/s de interés y las impurezas. Cuando se sintetizan los ingredientes farmacéuticos activos, a veces hay impurezas intermedias presentes en el producto final.

Imatinib es un inhibidor de la tirosina quinasa que se utiliza en el tratamiento de múltiples cánceres. Aquí, los productos intermedios y finales de la reacción se purificaron para la síntesis de Imatinib. En el primer paso, se realizó el screening de la mezcla utilizando tres columnas aquirales y metanol con y sin hidróxido de amonio como aditivo. Los resultados del screening se muestran en la figura 31. La columna BEH 2-EP y el metanol con hidróxido de amonio se eligieron como los mejores parámetros del método para la optimización y el escalado.

Para optimizar la separación para el escalado, se desarrollaron gradientes enfocados para el producto intermedio y el producto por separado. La concentración de coeluyente en el momento de la elución se calculó en función de la pendiente del gradiente del screening y el tiempo de retención para cada pico de interés. El producto intermedio se eluyó al 14 % de coeluyente mientras que el producto eluyó al 29 % de coeluyente. Se desarrollaron gradientes enfocados de 2 minutos centrados en esos porcentajes; comenzando un 5 % por debajo y terminando un 5 % por encima.

Para el escalado se utilizó la misma composición química de la columna y la relación entre la longitud y el tamaño de partícula (L/dp) se mantuvo constante. La columna analítica de 3 × 50 mm con partículas de 1,7 µm (L/dp = 29,4) se escaló a la columna preparativa de 19 × 150 mm con partículas de 5 µm (L/dp = 30). La cromatografía escalada (enfocada) y la colección dirigida por masas se muestran en la figura 32.