Guía de iniciación a la SFC preparativa

Trayectoria de flujo y hardware

Como resultado de los avances en los instrumentos modernos para la SFC preparativa, se han superado muchos de los obstáculos asociados con la SFC preparativa. La figura 7 muestra la trayectoria de flujo general para la instrumentación de la Prep SFC. La SFC utiliza la misma trayectoria de flujo básica que la HPLC, incluido el bombeo binario y el control de métodos, la introducción de muestras en la trayectoria de flujo mediante inyecciones, las separaciones en columnas, la detección de picos y la recolección de fracciones. En la SFC, se requieren tecnologías adicionales, principalmente para manejar la compresibilidad y la expansión del CO₂. Estas incluyen intercambiadores de calor (HE), reguladores de contrapresión (BPR), separadores de gas-líquido (GLS) y el uso casi universal de tubos de acero inoxidable de alta presión.

Consideraciones para cada componente

Bombeo: en la SFC, como en la LC, se utilizan sistemas de bombeo binario para suministrar un eluyente “A”, en este caso siempre CO₂, y un eluyente “B”, normalmente un eluyente orgánico polar como el metanol. Dependiendo de la escala del sistema, el CO₂ se suministra de dos maneras, ya sea volumétricamente (flujo volumétrico), que es típico en la escala analítica, o por masa (flujo másico), como se hace a menudo en la escala preparativa. Debido a que el CO₂ es compresible, los volúmenes idénticos no necesariamente equivalen a una masa idéntica debido a las diferencias de densidad. Cualquiera de los dos métodos de suministro es válido siempre que los caudales sean reproducibles, independientemente de las condiciones del entorno. En la mayoría de los casos, el CO₂ se enfría antes de la bomba o dentro de los cabezales de la bomba y después se bombea como líquido para reducir cualquier discrepancia en la densidad de la fase móvil. Además, todas las juntas, válvulas de retención, tubos y conectores deben poder administrar un líquido compresible a alta presión sin fugas. Debido a que el CO₂ se expande fácilmente a través de cualquier abertura, incluso una fuga pequeña puede tener un gran impacto en el rendimiento del sistema y la cromatografía. Un bombeo deficiente del CO₂, ya sea debido a fugas en los tubos, juntas o válvulas de retención, puede producir no solo cambios en el tiempo de retención y la selectividad, sino también un control deficiente de la presión (densidad) y ruido de la línea base.

Inyecciones: hay dos modos de inyección de uso común, flujo mixto y flujo modificador, que se analizarán en detalle en la sección “Estrategias de inyección en la SFC”. Los esquemas de inyección de la SFC de flujo mixto implican un paso de despresurización, que se utiliza para purgar cualquier CO₂ del bucle antes de cargar la muestra. La despresurización también se utiliza a veces en sistemas que realizan inyecciones tanto de flujo mixto como de flujo modificador como precaución de seguridad. Por lo general, esto se hace con una válvula de “purga” secundaria. Un inconveniente de esta configuración es el volumen extracolumna que se añade al sistema durante la inyección, lo que puede provocar el ensanchamiento de los picos y una pérdida de resolución. Al mantener el volumen al mínimo mediante tubos de diámetro interno pequeño, se reduce el ensanchamiento de los picos.

Horno de columna y calentamiento: en la SFC, la presión y la temperatura son parámetros del método que afectan a la separación porque afectan a la densidad de la fase móvil. Como resultado, es necesario un calentamiento y un control de la temperatura adecuados de la fase móvil y la columna. Si la temperatura no se controla correctamente, los gradientes de temperatura que se producen en la columna pueden tener efectos perjudiciales en la forma y la resolución de los picos. En muchos sistemas SFC, esto se logra calentando la columna en un horno o precalentando la fase móvil, o ambos.

Identificar la química correcta de la columna (tanto quiral como aquiral) es fundamental en la SFC. Por lo tanto, el screening de columnas es necesario en las aplicaciones SFC. Muchos sistemas SFC están equipados con algún tipo de válvula de conmutación incluida en el horno para elegir entre varias columnas. Esto es particularmente importante en aplicaciones en las que se purifican muchas muestras y dianas diferentes que probablemente requieran diferentes químicas de columna.

Detectores: todas las técnicas de detección típicas utilizadas en la purificación, como UV/Vis, PDA, MS y ELS, son compatibles con SFC y se pueden utilizar varios detectores en un solo sistema. Normalmente, los detectores UV/Vis y PDA se conectan a la trayectoria del flujo principal porque son detectores no destructivos y se utilizan para la detección primaria. Las celdas de flujo de estos detectores deben tener una clasificación adecuada para las presiones utilizadas en la SFC. Los detectores destructivos, como el MS y el ELS, se conectan mediante la tecnología de divisor que tiene un control relativo de la proporción de división del flujo (split) y acondiciona el eluyente para optimizar la señal de detección. Se pueden registrar o utilizar varias señales (o canales) del detector para la activación de fracciones, lo que amplía el rango de aplicación de la tecnología tanto para la SFC analítica como para la preparativa. El uso de estos detectores en SFC se describe con más detalle en la sección “Detección óptica y MS en SFC” de este capítulo.

Regulador de contrapresión (BPR): el control de la densidad de la fase móvil a lo largo de la columna es uno de los factores más importantes en el diseño del instrumento SFC, ya que la solubilidad y el factor de retención de todos los compuestos están estrechamente relacionados con la densidad del fluido. El control de la densidad se logra principalmente controlando la presión dentro del sistema. El regulador de contrapresión es un dispositivo automatizado diseñado para controlar la presión poscolumna (contrapresión) del sistema a la presión especificada en el método. Para adquirir una cromatografía adecuada y repetible, la presión poscolumna debe permanecer constante (en el punto de ajuste) incluso en condiciones de gradiente y análisis a análisis. 

Aunque el CO₂ se considera supercrítico por encima de 74 bar (~1073 psi) y 31 °C, normalmente no se recomienda analizarlo en condiciones cercanas al punto crítico, ya que los pequeños cambios de temperatura o presión en esta región producen grandes cambios en la densidad. Como resultado, los métodos desarrollados en esta región serían menos robustos en términos de retención y resolución. Además, cuando se utilizan coeluyentes, la separación de fases es más probable en condiciones de baja presión, lo que da lugar a ruido de la línea base. Por lo tanto, la mayoría de los métodos de SFC utilizan puntos de ajuste de presión más altos, generalmente superiores a 100 bar (1450 psi).

Activadores de recogida: en Prep SFC, las colecciones se pueden activar en varios canales y detectores utilizando los modos de recogida de umbral, tiempo y pendiente (definidos en la tabla 3). La lógica booleana se utiliza para una recogida más inteligente, lo que requiere que se cumpla más de una condición antes de que se produzca la recogida. Las condiciones para la recogida pueden incluir combinaciones de modos, como umbral y tiempo, o combinaciones de señales del detector, como umbral de UV y confirmación de masa.

Tabla 3. Definiciones de los modos de recogida utilizados en la SFC preparativa.

El retardo del tiempo de recogida también es importante y se deben determinar los retardos adecuados entre el detector y el sistema de recogida para una recuperación óptima de los compuestos de interés. Al igual que en Prep HPLC, estos retrasos dependen de los caudales. En SFC, sin embargo, los cambios en el tiempo de recogida también acompañan a los cambios en la composición y la presión de la fase móvil. Con el uso de eluyentes complementarios y otras tecnologías para mitigar la expansión del CO₂, la sincronización se puede controlar mejor en una variedad de condiciones a un caudal establecido.

Estrategias de inyección en SFC

Actualmente, hay dos métodos para la inyección de muestras en aplicaciones de SFC: flujo mixto y flujo modificador. En la inyección de flujo mixto, toda la fase móvil (CO₂ y coeluyente) barre el bucle y transporta la muestra a la columna. Los problemas habituales de la inyección de flujo mixto son la distorsión de los picos y los cambios en el tiempo de retención provocados por los efectos de utilizar diluyentes fuertes. La práctica habitual es disolver la muestra en el modificador polar (coeluyente). El uso de un eluyente fuerte como el metanol hace que parte del analito no se absorba en la fase estacionaria, lo que da lugar a una ruptura o distorsión del pico. Para los picos que se retienen menos, hay un mayor impacto y la distorsión se vuelve más severa. A medida que aumenta el volumen de inyección, la acumulación de eluyente polar causa perturbaciones localizadas en la fase móvil, lo que distorsiona aún más los picos y disminuye la resolución. Esta estrategia de inyección también requiere despresurización, lo que puede tener un impacto en la carga de inyección y la repetibilidad. Con la inyección de flujo mixto, se ha demostrado que los diluyentes con polaridad similar a la del CO₂ (como el hexano, el heptano u otros eluyentes no polares) mejoran la forma de los picos (figura 8).

La segunda estrategia de inyección es la inyección de flujo modificador, en la que la muestra se inyecta en la parte orgánica de la fase móvil (coeluyente) antes de mezclarla con CO₂. Esto es similar a los esquemas de dilución en columna utilizados en la purificación por LC. La idea es mitigar el efecto del diluyente introduciendo la muestra sin afectar a la fuerza total de la fase móvil y manteniendo los porcentajes de eluyente programados durante la inyección y el análisis. En este caso, el diluyente debe coincidir con el coeluyente que se está utilizando para la separación; sin embargo, se pueden utilizar otros diluyentes. La inyección de flujo modificador mejora la forma y la resolución de los picos, lo que permite volúmenes de inyección más grandes y una mayor carga (figura 9).

Cuando se utiliza la inyección de flujo modificador a porcentajes bajos de coeluyentes, el tiempo necesario para aplicar la muestra a la cabeza de la columna aumenta debido al bajo caudal de la bomba de coeluyente. Debido a la fase móvil altamente difusiva, es posible que el aumento del tiempo de inyección produzca picos más anchos, en comparación con las inyecciones de flujo mixto. Sin embargo, la forma de los picos sigue mejorando en comparación con las inyecciones de flujo mixto de alto volumen a bajos porcentajes de coeluyente. Aunque el flujo mixto transfiere la muestra a la columna más rápido, la magnitud de la perturbación en estas condiciones supera cualquier beneficio. A medida que aumenta el porcentaje de coeluyente, la elección de la técnica de inyección se vuelve menos crítica, pero a porcentajes bajos de coeluyente el flujo modificador es significativamente mejor.

Detección de PDA y UV/Vis

Hay consideraciones específicas de SFC cuando se trata de la detección óptica en SFC. Los cambios en la densidad de la fase móvil y las diferencias en los índices de refracción entre el CO₂ y el coeluyente crean una deriva y ruido de la línea base en los detectores UV/Vis y PDA. Estos efectos son especialmente pronunciados en condiciones de gradiente. En los detectores PDA, la línea base se puede ajustar utilizando canales de longitud de onda individuales y una compensación de la longitud de onda que reduce el ruido de la línea base y aumenta la sensibilidad (figura 10). En los detectores UV/Vis, la configuración de una sola longitud de onda hace que el ruido y la deriva de la línea base sean menos pronunciados.

Desde el punto de vista del hardware, se han diseñado celdas de flujo específicas para soportar las altas presiones de las aplicaciones SFC y se pueden utilizar en los detectores Waters 2998 PDA y 2489 UV/Vis. Se han estudiado las propiedades del diseño de la celda de flujo, incluidos el camino óptico, la geometría y el material de la celda, para optimizar la detección en aplicaciones SFC.

Detección de MS

Una de las grandes ventajas de la SFC es la capacidad de emparejar la selectividad de fase normal con la compatibilidad con MS. En la SFC, el CO₂ no solo sustituye a los eluyentes no compatibles como los hexanos y heptanos, sino que también, a través de la expansión del gas, ayuda a la nebulización y a la formación de partículas dentro de la fuente de MS. La SFC es compatible con ESI, APCI y la adquisición en modo dual en una amplia gama de instrumentos de MS. El detector ACQUITY QDa de Waters es particularmente útil en Prep SFC porque es fácil de usar. Sin embargo, a porcentajes bajos de coeluyente, a menudo no hay suficientes iones presentes para una detección óptima de la señal. Por este motivo, se suele añadir un eluyente de acondicionamiento (o eluyente complementario) en la división para aumentar la señal en el MS. Un eluyente de acondicionamiento típico contiene una mezcla de metanol, agua y un aditivo (a menudo hidróxido de amonio o ácido fórmico). Se utilizan muchas otras mezclas de eluyentes de acondicionamiento, en un intervalo de caudales, en función de las preferencias del usuario, el tipo de instrumento de MS y la escala de la aplicación. En la figura 11, se pueden ver ejemplos de detección de MS-ESI en un detector ACQUITY QDa de Waters con y sin el eluyente de acondicionamiento.

Detección de ELS

SFC también es compatible con la detección de ELS. Al igual que con MS, se utiliza un split (división) y se añade eluyente complementario para mejorar la señal. Debido a que la fase móvil de la SFC es tan volátil, se requiere eluyente adicional para transportar la muestra y obtener una mejor señal en el detector ELS. Desde el punto de vista operativo, el ELSD se controla de forma similar para SFC que para LC.

Recogida en Prep SFC: consideraciones sobre la expansión de CO₂

Las propiedades de una fase móvil en expansión son importantes cuando se considera el control de la recogida en Prep SFC. En el punto crítico, 31 °C y 74 bar, la expansión volumétrica del CO₂ puro a las condiciones atmosféricas (1 bar y 15 °C) es de aproximadamente 250 veces.

En los sistemas de SFC preparativa, el CO₂ a alta presión sale por el regulador de contrapresión (BPR). Esta expansión volumétrica aumenta exponencialmente a medida que aumenta la presión del CO₂ que sale. En los sistemas binarios, como la fase móvil típica de SFC, la expansión disminuye a medida que disminuye la fracción de CO₂ y aumenta la parte orgánica. A medida que se produce la expansión, la capacidad de disolución de la fase móvil se reduce, tanto por la falta de poder de solvatación como por la refrigeración de Joule-Thomson. El enfriamiento también puede provocar la formación de hielo seco que puede obstruir los tubos. La falta de control de la expansión puede causar la distorsión de los picos en la trayectoria del flujo de recogida, lo que reduce la pureza de las fracciones. También puede provocar una pérdida de recuperación, ya que los compuestos de interés se eliminan como desechos o se pierden por vaporización en el punto de recogida.

Para obtener fracciones con éxito, se utilizan muchas estrategias en la instrumentación SFC para controlar la expansión del CO₂ y sus efectos. En primer lugar, para mitigar el enfriamiento y los problemas asociados, la fase móvil se calienta en el punto de expansión inicial, justo después del regulador de contrapresión. En segundo lugar, en muchos casos se añade un eluyente complementario orgánico, que no solo mantiene los compuestos en solución, sino que también ayuda a controlar la expansión al reducir la fracción volumétrica de CO₂. Tener un mejor control de la expansión mejora las formas de los picos posteriores a la BPR y la recuperación. Por último, se purga o se elimina el CO₂. Normalmente se utiliza algún tipo de dispositivo de separación de fases para este fin, como los ciclones de alta presión o los separadores de gas-líquido (GLS) (figura 12).

Los ciclones de alta presión empujan la parte más pesada (líquida) de la fase móvil hacia el exterior y el fondo del ciclón, al tiempo que permiten que el gas CO₂ se escape por el centro y la parte superior. De manera ventajosa, los ciclones de alta presión no requieren eluyente complementario (incluso a porcentajes de coeluyente más bajos) porque el poder de solvatación del CO₂ se mantiene a través de la válvula de recogida y se produce la separación de fases en los ciclones. Sin embargo, también existen varias desventajas. Los sistemas de recogida de alta presión requieren materiales de alta presión, como el acero inoxidable, y suponen un mayor riesgo para la seguridad debido a la nebulización y la expansión asociadas con la recuperación de fracciones. Estos sistemas también restringen al usuario a un número limitado de posiciones disponibles para la recogida en un formato de “lecho cerrado”. El separador de gas y líquido (GLS) es una opción alternativa de baja presión que presenta muchas ventajas. Los sistemas de baja presión permiten el uso de materiales de menor presión nominal y tienen un riesgo de seguridad significativamente menor. Y, aunque normalmente se requiere más eluyente para la recogida, la eliminación más completa de CO₂ en condiciones de baja presión hace que la recogida en lecho abierto sea una realidad, lo que aumenta considerablemente el número de fracciones que se pueden recoger y amplía la aplicabilidad de la tecnología.

Diversidad de selectividad y aplicabilidad

La Prep SFC proporciona un aumento excepcional en la selectividad del proceso de purificación. Si bien la SFC generalmente utiliza la separación de fase normal, la técnica es increíblemente flexible porque permite el uso de algunas columnas RPLC convencionales y eluyentes, lo que extiende el rango de compatibilidad del compuesto. La capacidad de abarcar este amplio intervalo de selectividad es una clara ventaja de la SFC, ya que proporciona separación ortogonal dentro de una sola plataforma, lo que agiliza todo el proceso de purificación.

Compatibilidad con SFC: solubilidad

La SFC funciona, a nivel básico, en un modo de separación cromatográfica en fase normal. En condiciones de funcionamiento típicas, la mayor parte de la fase móvil es CO₂ no polar emparejado con una pequeña fracción de eluyente orgánico polar, y la separación se produce en columnas rellenas de partículas pequeñas que contienen fases estacionarias relativamente polares con un amplio intervalo de funcionalidades. Debido a la baja viscosidad de la fase móvil y a las columnas de partículas pequeñas, la SFC se utiliza principalmente en aplicaciones de moléculas pequeñas. Sin embargo, la gama de aplicaciones de mayor peso molecular realizadas con SFC se expande continuamente. De lo contrario, la candidatura de un compuesto para SFC depende principalmente de la solubilidad. La SFC tiene un intervalo de solubilidad muy amplio. De hecho, como regla general, cualquier muestra que se pueda disolver en un eluyente orgánico es candidata a SFC. Esto es muy útil, porque muchas técnicas preparativas de muestras dan como resultado que las muestras se disuelvan en eluyentes orgánicos, que se pueden inyectar directamente en los instrumentos Prep SFC.

Un dato útil con respecto a la solubilidad de un compuesto en eluyentes orgánicos se relaciona con el coeficiente de partición, generalmente designado como LogP. Por lo general, el LogP es una medida de la lipofilia o hidrofobicidad de un compuesto. En concreto, es la relación de concentración de un compuesto en las dos fases de una mezcla de dos eluyentes inmiscibles en equilibrio; generalmente agua y 1-octanol. Debido a que el CO₂ es un eluyente no polar, los valores de LogP son un buen indicador de cómo se comportará un compuesto en condiciones de SFC. Los valores de LogP bajos indican una polaridad más alta, lo que da como resultado una menor solubilidad en CO₂ y una mayor afinidad por las composiciones químicas de la columna polar, mientras que los valores de LogP altos indican una polaridad baja, lo que da como resultado una mayor solubilidad de CO₂ y una menor afinidad por la columna. Lo contrario de esto es cierto en RPLC, donde la fase móvil es polar y la fase estacionaria es no polar.

En aplicaciones analíticas (UPC²), las muestras de menor carga y menos concentradas pueden admitir compuestos con valores de LogP entre -2 y 9. Sin embargo, en la SFC preparativa es importante que los compuestos permanezcan en solución cuando se introducen en CO₂ en condiciones de carga elevada. Las muestras que contienen compuestos muy polares o hidrofílicos en concentraciones y cantidades preparativas deben analizarse para determinar su solubilidad antes de inyectarlas en el sistema. Esto se suele hacer disolviendo la muestra en un eluyente orgánico adecuado, seguido de la introducción de una pequeña cantidad de hexano o heptano. Si la muestra precipita fuera de la solución, generalmente se considera no adecuada para la SFC preparativa.

Una desventaja de la Prep SFC es la escasa solubilidad de los compuestos altamente polares. Sin embargo, con la adición de una pequeña cantidad de agua (como aditivo, normalmente menos del 5 % v:v) a la parte orgánica de la fase móvil, la SFC se puede utilizar para un intervalo aún más amplio de polaridad de la muestra. El agua aumenta la solubilidad de los compuestos hidrofílicos, lo que hace posible la separación y purificación de esos compuestos. Por tanto, el alcance de la aplicabilidad de la SFC se puede ampliar al estudio de péptidos, proteínas, bases nucleicas y otros analitos hidrofílicos. Si bien se ha demostrado que esta técnica ayuda en las aplicaciones polares, se debe abordar con precaución en la SFC preparativa para evitar la precipitación de la muestra o la formación de hielo en la salida del sistema.

Aplicabilidad de SFC: coeluyentes

La selección del coeluyente es un parámetro clave en SFC para el desarrollo y la optimización de métodos cromatográficos. Tanto en la cromatografía líquida en fase normal como en la reversa, existen restricciones sobre la miscibilidad de los eluyentes. Los hidrocarburos alifáticos en fase normal y el agua en fase reversa limitan el intervalo de polaridad de los eluyentes que se pueden utilizar en esas separaciones. En la SFC, el CO₂ supercrítico es miscible con los eluyentes orgánicos de fase reversa y de fase normal, desde el metanol hasta los heptanos, lo que abre una amplia gama de opciones de selectividad de eluyentes para desarrollar una separación. Esta amplia gama de selectividad aumenta considerablemente la gama de aplicaciones compatibles con SFC.

Aplicabilidad de SFC: columnas

En la cromatografía de fase reversa, la mayoría de las separaciones se realizan en un número limitado de fases estacionarias, normalmente C₁₈ o columnas hidrofóbicas similares. En la SFC, se puede utilizar una amplia variedad de composiciones químicas de columnas quirales y aquirales que abarcan tanto el intervalo de fase reversa (no polar) como el de fase normal (polar). Los compuestos básicos, neutros y ácidos se eluyen bien en la mayoría de las columnas, lo que indica la idoneidad de la Prep SFC para una amplia gama de funcionalidades químicas. El uso de diversas columnas puede considerarse una desventaja; sin embargo, también es una oportunidad para optimizar la selectividad para purificar un compuesto en particular. Las modernas fases estacionarias de Prep SFC proporcionan un potencial adicional para un mayor uso de la SFC para la purificación quiral y aquiral. En particular, las columnas Viridis y Torus de Waters están diseñadas específicamente para la aplicación de SFC y ofrecen una mayor estabilidad, un amplio intervalo de selectividad y una mejor forma de los picos, lo que reduce la necesidad de aditivos. La tabla 4 muestra una lista de columnas de Waters que cubren el intervalo de aplicabilidad de Prep SFC. La selección de columnas es un parámetro clave en el desarrollo y la optimización de métodos.

Separación quiral

La SFC es, con mucho, la mejor solución cromatográfica para separar compuestos quirales, ya que proporciona mejoras considerables en la eficacia y la velocidad de separación en comparación con otras técnicas cromatográficas, como la HPLC en fase normal. Las separaciones quirales se consiguen habitualmente mediante HPLC en fase normal. En la SFC, estas separaciones se realizan en mucho menos tiempo, a la vez que aumentan la resolución y reducen el consumo de eluyente.

Por lo tanto, las columnas quirales se utilizan mucho en el entorno SFC, no solo para aplicaciones quirales, sino también para la separación de diastereoisómeros, metabolitos, regioisómeros y otros compuestos estructuralmente relacionados. Si bien las fases basadas en celulosa y amilosa son las más populares, también son compatibles otras fases estacionarias quirales. Esto tiene ventajas en la purificación de estos compuestos, como fracciones de mayor pureza, mayor eficacia y ahorro de costes debido a la reducción del uso de eluyentes. La figura 13 muestra la separación quiral de los enantiómeros y diastereómeros de la permetrina utilizando tanto HPLC en fase normal como SFC.

Los cuatro picos no se pudieron resolver mediante HPLC; sin embargo, se resolvieron en menos tiempo y utilizando una columna más corta con SFC.