Guía de iniciación a UPLC

En la sección anterior, se estableció la ventaja de las partículas cromatográficas más pequeñas y el ensanchamiento de banda del sistema minimizado [tanto en el instrumento como en la columna]. La tecnología UPLC facilita el rendimiento cromatográfico mejorado al minimizar el ensanchamiento de banda del sistema para producir separaciones más eficaces en menos tiempo, logrando así una mejor calidad de los datos. Sin embargo, el ensanchamiento de banda no es el único factor que determina el rendimiento que se puede lograr con partículas pequeñas. La presión disponible del instrumento también desempeña un papel importante.

La presión se genera de forma inherente cuando la fase móvil pasa a través del tubo conector de la bomba al inyector, del inyector a la columna, de la propia columna, de la poscolumna del tubo y de la celda del detector. La medición de la presión del sistema es un efecto acumulativo de todos estos componentes [instrumento y columna]. A medida que aumenta el flujo, aumentará la presión producida por la fase móvil que fluye a través del propio tubo conector. Además, el diámetro interno del tubo, así como su longitud, también afectarán a la cantidad de presión que se generará en combinación con el flujo. La diferencia de presión entre dos columnas se puede comparar con las predicciones teóricas si la presión generada por el propio instrumento se resta de la presión total del sistema [instrumento + columna].

A medida que se reduce el tamaño de las partículas, la contrapresión aumenta a una velocidad inversamente proporcional al cuadrado del diámetro de las partículas. Simultáneamente, la velocidad óptima de la fase móvil [velocidad lineal] aumenta al disminuir el diámetro de las partículas. Por lo tanto, la presión a la velocidad lineal óptima para un tamaño de partícula determinado aumenta a una velocidad inversamente proporcional al cubo del diámetro de las partículas [Figura 44].

Esta es una limitación importante cuando se intenta utilizar columnas de partículas más pequeñas en instrumentos HPLC convencionales para mejorar la resolución cromatográfica [manteniendo constante la longitud de la columna mientras se reduce el tamaño de las partículas] o para mejorar la velocidad del análisis mientras se mantiene la resolución [manteniendo constante la ratio L/d_p]. Debido a las limitaciones de presión de los instrumentos HPLC convencionales

[350–400 bar; 5000-6000 psi], el uso de partículas más pequeñas a menudo da lugar a una restricción de la longitud de la columna o a un funcionamiento a velocidades lineales [flujos] no óptimas.

Para una longitud de columna constante, la teoría predice que si el tamaño de partícula disminuye de 5,0 µm a 1,7 µm [disminución de 3´ en el tamaño de partícula], se prevé que la contrapresión aumentará 27´. De manera similar a las predicciones teóricas, la presión del sistema aumentó 22’ al pasar de una columna de 5,0 µm a una columna de 1,7 µm de la misma longitud. Como se observa, la columna de 1,7 µm funciona muy por encima del límite de presión superior de un instrumento HPLC convencional [Figura 45].

El gran aumento de la contrapresión observado por la disminución del tamaño de las partículas es una de las principales razones por las que las columnas de partículas inferiores a 2 µm [y los instrumentos de LC correspondientes] nunca tuvieron éxito comercial hasta la llegada del sistema ACQUITY UPLC.

Si el objetivo de la separación es mantener la resolución mientras se reduce el tiempo de análisis [manteniendo constante la ratio L/d_p], el aumento de presión es mucho menor que mantener constante la longitud de la columna mientras se reduce el tamaño de las partículas. El cambio de presión es inversamente proporcional al cuadrado del tamaño de las partículas [en lugar del tamaño de las partículas al cubo] debido a la reducción proporcional de la longitud de la columna.

En este ejemplo, tanto la longitud de la columna como el tamaño de las partículas se reducen 3’ [Figura 47]. Esto significa que se prevé que la contrapresión aumentará 9´. Los valores observados coinciden estrechamente con las predicciones teóricas. Manteniendo L/d_p constante, se observa un aumento de 11´ en la contrapresión al pasar de una columna de 5,0 µm y 150 mm de longitud a una columna de 1,7 µm y 50 mm de longitud.

Cuando se procesan a su flujo óptimo, la presión producida por las partículas más pequeñas superará las limitaciones de presión de los sistemas HPLC convencionales. El sistema ACQUITY UPLC [límite de presión superior de 1030 bar, 15 000 psi] se diseñó para adaptarse a estas presiones, lo que permite analizar correctamente las partículas inferiores a 2 µm a su flujo óptimo.

Temperatura elevada

Un método para compensar las presiones más altas producidas por las partículas pequeñas consiste en elevar la temperatura de la columna. A medida que aumenta la temperatura de la columna, disminuye la viscosidad de la fase móvil, lo que da como resultado una contrapresión más baja [si el flujo se mantiene constante]. Sin embargo, la velocidad a la que las moléculas de analito entran y salen de los poros de la fase estacionaria [difusión] también aumenta, lo que hace necesario aumentar el flujo para mantener el rendimiento.

Al aumentar la temperatura de la columna de 30 °C a 90 °C, se debe aumentar el flujo para mantener la eficacia [Figura 48]. No se observa ganancia de eficacia al comparar el número de platos más alto a cualquiera de las dos temperaturas, lo que coincide con la teoría cromatográfica.

Se puede realizar una comparación más eficaz si se representa el número de platos frente a la presión del sistema [Figura 49]. Al trazar los datos de esta manera, se ve claramente que la máxima eficacia de la columna se logra aproximadamente a la misma presión del sistema, independientemente de la temperatura de separación. Esto significa que no se puede utilizar una temperatura elevada para eludir las presiones asociadas con el uso de partículas pequeñas. En otras palabras: un instrumento HPLC convencional no es adecuado para el uso eficiente de partículas muy pequeñas.