Guía de iniciación a UPLC

Al comprender los principios cromatográficos descritos en este manual y cómo se aplican, se hace evidente que hay que tener en cuenta algo más que las partículas pequeñas y una mayor presión para maximizar el rendimiento de la separación. Para obtener la ventaja cromatográfica de las columnas de partículas inferiores a 2 µm, es necesario pasar estas columnas en un instrumento diseñado específicamente para admitir las presiones producidas por partículas más pequeñas, así como para minimizar el ensanchamiento de banda. Esto no se puede lograr con los sistemas HPLC convencionales.

El sistema ACQUITY UltraPerformance LC es una solución de diseño integral que mejora el rendimiento y la calidad de los datos analíticos de las separaciones cromatográficas teniendo en cuenta todos los aspectos del diseño del instrumento y la columna.

Debe quedar claro que la clave para las separaciones UPLC es la combinación del rendimiento del instrumento y la columna que permite a los cromatógrafos obtener y aprovechar por completo la potencia de las columnas de partículas inferiores a 2 µm. Esto se logra minimizando el ensanchamiento de banda dentro [dentro de la columna] y fuera [fuera de la columna] de la columna y pudiendo funcionar a las velocidades [y presiones] óptimas de estas columnas de partículas pequeñas [Figura 51].

Maximizar el poder de separación

Para maximizar el poder de separación, se puede combinar el uso de partículas pequeñas con temperatura y presión elevadas para desarrollar separaciones de eficacia ultraelevada utilizando la tecnología UPLC.

La Figura 52A es una sola columna UPLC de 150 mm de longitud y 1,7 µm que produce poco menos de 40 000 placas a 90 °C. Se añadió una segunda columna en serie para producir una longitud de 300 mm, lo que dio como resultado un número de platos de 83 000 [Figura 52B]. Se aprovecha todo el intervalo de presión del sistema ACQUITY UPLC añadiendo una tercera columna en serie, lo que da como resultado una columna UPLC de 450 mm de longitud rellena con partículas de 1,7 µm. Como se observa en la Figura 52C, se logra una eficacia de 121 000 platos en solo 8 minutos.

La potencia de separación del gradiente también se puede aumentar a través de la misma lógica. En este ejemplo, se conectaron en serie dos columnas UPLC de 150 mm de longitud y 1,7 µm [longitud total de 300 mm] para mejorar drásticamente la información obtenida para la identificación de metabolitos [Figura 53]. Se alcanzó una capacidad máxima superior a 1000 en un tiempo de análisis de una hora. La capacidad de caracterizar completamente esta muestra de orina permite la identificación de metabolitos de fármacos candidatos, la detección e identificación de marcadores de toxicidad y la detección de toxinas en la monitorización de fármacos terapéuticos. En este caso, el poder de resolución y, por lo tanto, la calidad del espectro de masas mejora drásticamente, lo que simplifica el análisis de los datos, mejora los límites de detección y aumenta la fiabilidad del ensayo.

Un solo sistema para separaciones por HPLC y UPLC

El sistema ACQUITY UPLC está diseñado para hacer frente a los crecientes desafíos organizativos para entregar productos al mercado más rápidamente, manteniendo o mejorando la calidad de la información. Desde 2004, innumerables organizaciones han adoptado la tecnología UPLC como plataforma analítica de rutina, en sustitución de la HPLC convencional.

Al adoptar una nueva tecnología, es importante tener en cuenta su capacidad para satisfacer las exigencias actuales y futuras. Con la tecnología UPLC, se puede invertir en el futuro utilizando un solo sistema con la capacidad de analizar de forma óptima columnas con partículas inferiores a 2 μm, y la solidez y la robustez necesarias para ejecutar métodos de HPLC heredados. Esto significa que se puede utilizar una única plataforma de tecnología independientemente de las necesidades de separación, lo que facilita la mejora de la productividad al simplificar la transferencia de métodos de un sitio a otro.

La Figura 54 muestra un ejemplo de la capacidad de ejecutar el sistema ACQUITY UPLC como un HPLC estándar. Este es el método USP para Excedrin [analgésico de venta libre] analizado en un sistema HPLC convencional [Figura 54A] y en un sistema ACQUITY UPLC [Figura 54B]. El método cromatográfico, las fases móviles, la muestra y la columna simplemente se movieron de un instrumento a otro. Como resultado del diseño óptimo del sistema, se observa una mayor eficacia y sensibilidad para el mismo ensayo en el sistema ACQUITY UPLC sin cambios en la selectividad o la retención relativa.

Conclusión

Este manual tecnológico se ha diseñado para proporcionar al lector una comprensión básica de los principios cromatográficos en los que se basa la tecnología UPLC. Esperamos que el usuario comprenda ahora las mejoras significativas en la resolución, la sensibilidad y la velocidad que se pueden respecto a las separaciones cromatográficas minimizando las contribuciones de ensanchamiento de banda tanto del instrumento como de la columna. Además de un ensanchamiento de banda mínimo, este sistema debe ser capaz de funcionar a la velocidad [y presión] lineales óptimas para columnas de partículas pequeñas [inferiores a 2 µm]. El sistema ACQUITY UPLC se ha diseñado para satisfacer las necesidades presentes y futuras de los especialistas en separaciones.

Las ventajas teóricas de eficacia y resolución descritas en este manual se predijeron hace décadas. La teoría se puso en práctica por primera vez a escala comercial con la introducción del sistema ACQUITY UPLC en 2004. Desde entonces, miles de especialistas de separaciones de todo el mundo han adoptado la tecnología UPLC y los beneficios prácticos que puede proporcionar a su organización. El sistema ACQUITY UPLC permite a las organizaciones gestionar de forma más eficaz los activos de la empresa, mejorando la calidad de la información cromatográfica y reduciendo el tiempo necesario para adquirir esta información. Esto impulsa la productividad de la organización al superar muchos de los desafíos y cuellos de botella presentes en el laboratorio de separaciones analíticas. Además de proporcionar un ahorro considerable en los costes de los consumibles, las separaciones más cortas y más fiables también benefician al medio ambiente al requerir cantidades significativamente menores de eluyentes orgánicos. 

Curiosamente, la mayoría de los principales fabricantes de instrumentos, que originalmente minimizaron la importancia de un sistema cromatográfico con mayor capacidad de presión [citando problemas sobre la seguridad, la robustez, la compatibilidad de las muestras, etc. ], ahora han validado la necesidad de una plataforma de LC de este tipo mediante el desarrollo de varios sistemas propios con mayor capacidad de presión. Aunque estos sistemas conllevan algunos inconvenientes [p. ej., límites de presión más bajos, gran ensanchamiento de banda, opciones de detección limitadas, etc.], esta tendencia inconfundible hacia un mayor rendimiento cromatográfico indica que las técnicas de separación siguen avanzando.

Referencias de lectura adicional:

1. U.D. Neue, “HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice”, Wiley-VCH [1997]
2. J.C. Aresenault y P.D. McDonald, “Beginners Guide to Liquid Chromatography”, Waters [2009]
3. P.D. McDonald, “The Quest for Ultra Performance in Liquid Chromatography: Origins of UPLC Technology”, Waters [2009]
4. M.P. Balogh, “The Mass Spectrometry Primer”, Waters [2009]