Guía de iniciación a SPE
Una potente herramienta para mejorar la preparación de muestras
Como científico especializado en análisis, se enfrenta a muchos desafíos a la hora de decidir qué herramientas se pueden utilizar de la mejor manera para lograr el resultado deseado. Determinar las herramientas y los métodos para la preparación de muestras son consideraciones importantes que pueden impactar de forma considerable en su éxito.
Lo ideal sería que no tuviese que realizar ninguna preparación de muestras. Sin embargo, en la realidad, a menudo es necesaria dicha preparación. Es posible que tenga que optimizar un método para una muestra existente con el fin de mejorar el rendimiento o reducir el coste por análisis. O bien, es posible que se le pida que analice una amplia variedad de diferentes tipos de muestras para presentar resultados sobre nuevos compuestos de interés. Cada tipo nuevo de muestra puede presentar distintos desafíos analíticos. Además, los científicos se enfrentan en la actualidad al importante desafío de reportar valores a niveles de concentración más bajos que nunca, sin comprometer la exactitud ni la precisión.
Este libro está diseñado para ayudarle a explorar y comprender una herramienta muy potente en la tecnología de preparación de muestras: la extracción en fase sólida [SPE]. Verá cómo esta tecnología, que utiliza dispositivos con material de relleno cromatográfico, puede ayudarle a superar los desafíos analíticos.
Definición de extracción en fase sólida
La SPE es una tecnología de preparación de muestras que utiliza material de relleno cromatográfico de partículas sólidas, normalmente contenido en un dispositivo de tipo cartucho, para separar químicamente los diferentes componentes de una muestra. Las muestras casi siempre están en estado líquido [aunque se pueden llevar a cabo aplicaciones especializadas con algunas muestras en fase gaseosa]. En la figura 1 se observa una muestra, que aparece de color negro, que se está procesando en un dispositivo SPE para que los compuestos de colorante individuales, que constituyen la muestra, se separen mediante cromatografía.
Figura 1. Ejemplos de un método de SPE.
El lecho cromatográfico se puede utilizar para separar los diferentes compuestos en una muestra y hacer que las pruebas analíticas posteriores tengan más éxito. Por ejemplo, la SPE se utiliza con frecuencia para la eliminación selectiva de interferencias.
El nombre técnicamente correcto para esta tecnología es “Extracción en fase líquida-sólida”, ya que las partículas cromatográficas son sólidas y la muestra está en estado líquido. Los mismos principios cromatográficos básicos de la cromatografía líquida que se utilizan en HPLC también se utilizan aquí, pero en un formato distinto y por una razón diferente. Aquí, la cromatografía se utiliza para preparar mejor una muestra antes de enviarla para realizar pruebas analíticas.
En la preparación de muestras, estas pueden provenir de orígenes muy diversos. Pueden ser líquidos biológicos como el plasma, la saliva o la orina; muestras medioambientales como el agua, el aire o el suelo; productos alimenticios como los cereales, las carnes y los mariscos; productos farmacéuticos; productos nutracéuticos; bebidas o productos industriales. ¡Incluso las cabezas de los mosquitos pueden ser la muestra! Cuando un científico necesitaba analizar los neuropéptidos extraídos del cerebro de los mosquitos, la SPE era el método de elección para la preparación de muestras (Waters Applications Database, 1983).
Cuatro ventajas principales de la SPE
El uso de la SPE proporciona muchas ventajas, pero hay cuatro ventajas principales que merecen especial atención.
1. Simplificación de la matriz de muestra compleja junto con la purificación del compuesto
Uno de los problemas más difíciles para un químico analítico es cuando los compuestos de interés están contenidos en una matriz de muestras compleja, como micotoxinas en los cereales, residuos de antibióticos en las gambas o metabolitos de fármacos en el plasma, el suero o la orina. El gran número de componentes o sustancias que interfieren en la matriz de la muestra junto con los compuestos de interés dificulta extremadamente el análisis.
El primer problema que se ha de solucionar es la complejidad como resultado del propio análisis, debido a la presencia de tantas entidades que deben separarse para identificar y cuantificar los compuestos de interés. Consulte la figura 2.
Figura 2. Ejemplo de una muestra compleja.
La robustez del ensayo puede no ser suficiente, ya que cualquier ligero cambio podría afectar a la resolución de la separación de un par crítico de analitos.
Otra consideración es que la presencia de todas las interferencias en la matriz de la muestra original puede provocar paradas del instrumento, debido a la contaminación que se acumulada en cada inyección. Si se eliminasen las interferencias como parte de la preparación de la muestra, entonces los compuestos de interés podrían analizarse con un método más sencillo y robusto. Esto se puede ver en la figura 3, que compara la muestra original en la parte superior con la nueva muestra preparada mediante SPE en la parte inferior.
Figura 3. Comparación de las complejidades de la matriz de la muestra.
Una ventaja adicional de simplificar la matriz de la muestra es la mejora en la exactitud de la cuantificación. El trazado azul superior para el compuesto 1 en la figura 4 parece inicialmente aceptable. Sin embargo, en realidad contiene algo de contaminación procedente de la matriz de la muestra como puede verse al compararse con el trazado en rojo del blanco de matriz de muestra que se indica justo debajo. Con un protocolo de SPE adecuado, los trazados inferiores muestran los mismos compuestos sin problemas de interferencias, lo que hace que la cuantificación sea mucho más exacta.
Figura 4. Mejora en la cuantificación con una mejor preparación de muestras.
En la figura 5 se indica otro ejemplo. El trazado superior muestra una interferencia significativa de la matriz de la muestra en los compuestos 1 y 2. El trazado inferior muestra resultados mucho mejores [línea base limpia], debido a una preparación adecuada de las muestras mediante SPE. Observe que una línea base mucho más limpia mejora la exactitud de los resultados analíticos. Además, se puede obtener un extracto mucho más puro si la muestra requiere aislamiento y purificación de dicho compuesto.
Figura 5. Mejora significativa en la línea base con el uso de la tecnología SPE.
2. Reducir la supresión de iones o la mejora de ionización en aplicaciones de MS
El segundo problema con las matrices de muestras complejas se puede ver al observar los resultados del espectrómetro de masas [LC-MS o LC/MS/MS]. Para una respuesta adecuada de la señal de MS [sensibilidad], se debe permitir la formación correcta del ion. En los casos en los que la formación del ion se suprime por interferencias en la matriz de la muestra, la intensidad de la señal disminuye considerablemente.
En la figura 6 puede observarse este efecto. El resultado superior corresponde a la señal para nuestros compuestos de interés cuando se inyectan en una solución salina. El trazado inferior muestra una reducción significativa en la respuesta [supresión >90 %] de estos mismos compuestos cuando se analizaron en plasma humano. Para el trazado inferior, solo se realizó un paso habitual de precipitación de proteínas. Esta técnica no elimina las interferencias de la matriz que causan la supresión de iones, lo que da como resultado una respuesta de señal baja.
Figura 6. Ejemplo de supresión de iones a causa de la matriz de muestras.
En la figura 7 se puede observar otro buen ejemplo de este efecto de supresión. En el trazado superior del resultado MS, donde se preparó la muestra de plasma mediante un solo paso de precipitación de proteínas, se puede ver una supresión del 80 % del pico de terfenadina. En el trazado inferior, donde se preparó la misma muestra con un método de SPE, se puede observar una supresión de iones mínima. Debido a la eliminación de las interferencias de la matriz de muestras, el ion pudo formarse correctamente, produciendo una mejor señal.
Figura 7. Reducción de la supresión de iones con un método de SPE adecuado.
En algunos casos, las interferencias de la matriz de muestra pueden aumentar de forma artificial la señal obtenida para un compuesto. Esto se denomina mejora de ionización y da lugar a un valor reportado erróneamente alto. Un método de SPE adecuado reducirá al mínimo este efecto al eliminar las interferencias del compuesto, lo que dará como resultado un valor reportado más exacto.
3. Capacidad de fraccionar la matriz de muestras para analizar compuestos según su clase
Un analista puede encontrarse con una muestra que contenga muchos compuestos, con la necesidad de separarlos por clase para poder realizar un análisis posterior de manera mucho más eficiente. Por ejemplo, un refresco contiene una amplia gama de compuestos en su formulación. Podría desarrollarse un método de SPE para separar las distintas clases de compuestos, por ejemplo, según su polaridad. Podrían recogerse los compuestos polares como una fracción separada de los compuestos más apolares. Podrían analizarse estas dos fracciones por separado de una manera mucho más eficiente, ya que sus compuestos serían más parecidos.
En la figura 8 se indica un ejemplo del poder de fraccionamiento mediante SPE. Aquí, se separa fácilmente una muestra compleja de un polvo seco [mezcla para bebida de uva morada] en cuatro fracciones: una fracción solo de los compuestos polares, un compuesto rojo purificado, un compuesto azul purificado y una fracción que contiene todos los compuestos restantes muy apolares. En otros apartados de este libro verá el alcance del potencial de esta capacidad.
Figura 8. Preparación de muestras mediante SPE.
Para obtener información más detallada del fraccionamiento de muestras mediante SPE, consulte la página 125 en la sección Desarrollo de métodos.
4. Concentración [enriquecimiento] de trazas de compuestos de muy bajo nivel
Los analistas de hoy en día necesitan reportar con frecuencia la presencia de compuestos a niveles de concentración mucho más bajos que nunca, en unidades como partes por trillón [ppt] e incluso más bajas. Normalmente, estos niveles en la muestra disuelta están por debajo de la capacidad de sensibilidad de los instrumentos analítico
Un buen ejemplo de esto es el análisis para detectar trazas de contaminantes en muestras medioambientales o la formación de metabolitos a lo largo del tiempo en líquidos biológicos. En el trazado superior de la figura 9 se indica la mala respuesta de la muestra disuelta original para el compuesto de interés. Utilizando las mismas condiciones analíticas pero con la muestra preparada mediante SPE utilizada en una estrategia de concentración de trazas, el trazado inferior muestra un aumento drástico en la intensidad de la señal para este compuesto. Con este resultado se puede realizar un cálculo exacto de la concentración original del compuesto en la muestra disuelta.
Figura 9. Ejemplo de concentración de trazas.
Sin la capacidad de retención de los materiales de relleno cromatográficos en la SPE, la capacidad de concentrar trazas de un compuesto específico sería muy difícil, si no imposible, con otros métodos de preparación de muestras.
Resumen
Como hemos visto, un dispositivo SPE con lecho cromatográfico puede realizar cuatro funciones esenciales para que el análisis de la muestra sea más satisfactorio. Consulte la figura 10.
Figura 10. El potencial de SPE.
En este libro nos hemos esforzado por proporcionar todos los fundamentos y técnicas de éxito de la SPE provenientes de científicos de todo el mundo que han confiado en esta tecnología durante los últimos treinta años. Hoy en día, los científicos están descubriendo que la SPE es más útil que nunca a la hora de resolver problemas analíticos y de preparación de muestras complicados.
Esperamos que este libro le permita comprender y dominar las capacidades de la SPE, para que usted también pueda poner en práctica el potencial de esta tecnología en su laboratorio.
