Guía de iniciación a la cromatografía líquida

En general, se pueden utilizar tres características principales de los compuestos químicos para crear separaciones por HPLC. Son:

• Polaridad
• Carga eléctrica
• Tamaño molecular

En primer lugar, se supone que la polaridad y los dos modos de separación principales aprovechan esta característica: la cromatografía de fase normal y de fase reversa.

Separaciones basadas en la polaridad

La estructura, la actividad y las características fisicoquímicas de una molécula están determinadas por la disposición de los átomos que la componen y los enlaces entre ellos. Dentro de una molécula, una disposición específica de ciertos átomos que es responsable de propiedades especiales y reacciones químicas predecibles se denomina grupo funcional. Esta estructura a menudo determina si la molécula es polar o no polar. Las moléculas orgánicas se clasifican en clases de acuerdo con los principales grupos funcionales que contiene. Al utilizar un modo de separación basado en la polaridad, la retención cromatográfica relativa de diferentes tipos de moléculas está determinada en gran medida por la naturaleza y la ubicación de estos grupos funcionales. Como se muestra en la figura P, las clases de moléculas se pueden ordenar por su retención relativa en un intervalo o espectro de polaridad cromatográfica de muy polar a muy no polar.

El agua [una molécula pequeña con un momento dipolar elevado] es un compuesto polar. El benceno [un hidrocarburo aromático] es un compuesto no polar. Las moléculas con polaridad cromatográfica similar tienden a ser atraídas entre sí; aquellas con polaridad diferente exhiben una atracción mucho más débil, si la hay, e incluso pueden repelerse entre sí. Esto se convierte en la base para los modos de separación cromatográfica basados en la polaridad.

Otra forma de pensar en esto es mediante la analogía familiar: el aceite [no polar] y el agua [polar] no se mezclan. A diferencia del magnetismo, en el que los polos opuestos se atraen, las separaciones cromatográficas basadas en la polaridad dependen de la atracción más fuerte entre los similares y la atracción más débil entre los opuestos. Se debe recordar que «Lo semejante atrae a lo semejante» en la cromatografía basada en polaridad.

Para diseñar un sistema de cromatografía [ver la figura Q], creamos competencia para los diversos compuestos contenidos en la muestra eligiendo una fase móvil y una fase estacionaria con diferentes polaridades. A continuación, los compuestos de la muestra que tienen una polaridad similar a la de la fase estacionaria [material de relleno de la columna] se retrasarán porque las partículas los atraen con más fuerza. Los compuestos cuya polaridad es similar a la de la fase móvil serán atraídos preferentemente por ella y se moverán más rápido.

De esta forma, basándose en las diferencias en la atracción relativa de cada compuesto para cada fase, se crea una separación cambiando las velocidades de los analitos.

Las figuras R-1, R-2 y R-3 muestran los intervalos de polaridad cromatográfica típicos para las fases móviles, las fases estacionarias y los analitos de la muestra, respectivamente. Consideremos cada una de ellas para ver cómo elige un cromatografista las fases adecuadas para desarrollar la competencia de atracción necesaria para lograr una separación por HPLC basada en la polaridad.

Una escala, como la que se muestra en la figura R-1, en la que se colocan algunos eluyentes comunes en orden de polaridad cromatográfica relativa se denomina serie eluotrópica. Las moléculas de la fase móvil que compiten eficazmente con las moléculas del analito por los lugares atractivos de la fase estacionaria desplazan a estos analitos, lo que hace que se muevan más rápido a través de la columna [débilmente retenidos]. El agua está en el extremo polar de la escala de eluyente de la fase móvil, mientras que el hexano, un hidrocarburo alifático, está en el extremo no polar. En el medio, los eluyentes individuales, así como las mezclas de eluyentes miscibles [mezclados en proporciones adecuadas para cumplir con los requisitos de separación específicos], se pueden colocar en orden de fuerza de elución. El extremo de la escala que representa la fase móvil «más fuerte» depende de la naturaleza de la superficie de la fase estacionaria en la que se produce la competencia por las moléculas del analito.

La sílice tiene una superficie hidrofílica activa [amante del agua] que contiene grupos funcionales ácidos de silanol [análogo del alcohol que contiene silicio]. En consecuencia, cae en el extremo polar de la escala de fase estacionaria que se muestra en la figura R-2. La actividad o polaridad de la superficie de la sílice puede modificarse selectivamente uniendo químicamente los grupos funcionales menos polares [fase de unión]. Los ejemplos que se muestran aquí incluyen, en orden de polaridad decreciente, las moléculas cianopropilsilil- [CN], n-octilsilil- [C₈] y n-octadecilsilil- [C₁₈, ODS] sobre sílice. Este último es un relleno hidrofóbico [que odia el agua], muy no polar.

La figura R-3 repite el espectro de polaridad cromatográfica de la muestra [que se muestra en la figura P]. Después de considerar la polaridad de ambas fases, para una fase estacionaria determinada, el cromatografista debe elegir una fase móvil en la que se retengan los analitos de interés, pero no con tanta fuerza que no puedan eluirse. Entre los eluyentes de fuerza similar, el cromatografista considera qué combinación de fases puede aprovechar mejor las diferencias más sutiles en la polaridad y solubilidad del analito para maximizar la selectividad del sistema cromatográfico. Los semejantes atraen a los semejantes, pero, como probablemente se puede imaginar a partir del debate llevado a cabo hasta ahora, crear una separación basada en la polaridad implica el conocimiento de la muestra y la experiencia con varios tipos de analitos y modos de retención. En resumen, el cromatografista elegirá la mejor combinación de una fase móvil y una fase estacionaria de partículas con polaridades adecuadamente opuestas. Entonces, a medida que los analitos de la muestra se mueven a través de la columna, la regla de que lo semejante atrae a lo semejante determinará qué analitos se ralentizan y cuáles avanzan a mayor velocidad.

HPLC en fase normal

En sus separaciones de extractos de plantas, Tswett tuvo éxito utilizando una fase polar estacionaria [creta en una columna de vidrio; ver la figura A] con una fase móvil mucho menos polar [no polar]. Este modo clásico de cromatografía se conoce como fase normal.

La figura S-1 representa una separación cromatográfica en fase normal de nuestra mezcla de prueba de tres colorantes. La fase estacionaria es polar y retiene el colorante amarillo polar con mayor fuerza. El colorante azul, relativamente no polar, es ganado en la competencia de retención por la fase móvil, un eluyente no polar, y eluye rápidamente. Dado que el colorante azul se parece más a la fase móvil [ambas son no polares], se mueve más rápido. Para la cromatografía en fase normal sobre sílice es habitual que la fase móvil sea 100 % orgánica; no se utiliza agua.

HPLC de fase reversa

El término fase reversa describe el modo de cromatografía que es justo lo contrario de la fase normal, es decir, el uso de una fase móvil polar y una fase estacionaria [hidrofóbica] no polar. La figura S-2 ilustra la separación de la mezcla de tres colorantes negros utilizando dicho protocolo.

Ahora, el compuesto más fuertemente retenido es el colorante azul más no polar, ya que su atracción hacia la fase estacionaria no polar es mayor. El colorante amarillo polar, que se retiene débilmente, es ganado en competencia por la fase móvil acuosa polar, se mueve más rápido a través del lecho y eluye antes lo semejante atrae a lo semejante.

En la actualidad, debido a que es más reproducible y tiene una amplia aplicabilidad, la cromatografía de fase reversa se utiliza para aproximadamente el 75 % de todos los métodos de HPLC. La mayoría de estos protocolos utilizan como fase móvil una mezcla acuosa de agua con un eluyente orgánico polar miscible, como acetonitrilo o metanol. Esto normalmente asegura la interacción adecuada de los analitos con la superficie de las partículas hidrofóbicas no polares. La sílice unida con C₁₈ [a veces llamada ODS] es el tipo más utilizado de relleno para HPLC de fase reversa.

La tabla C presenta un resumen de las características de fase para los dos modos principales de separación por HPLC en función de la polaridad. Hay que recordar que para estos modos basados en polaridad, lo semejante atrae a lo semejante.

Cromatografía de interacción hidrofílica [HILIC]

La HILIC puede verse como una variante de la cromatografía en fase normal. En la cromatografía en fase normal, la fase móvil es 100 % orgánica. Solo hay trazas de agua en la fase móvil y en los poros de las partículas de relleno polares. Los analitos polares se unen fuertemente a la fase estacionaria polar y pueden no eluir.

La adición de un poco de agua [<20 %] a la fase móvil orgánica [normalmente un eluyente aprótico como el acetonitrilo] permite separar y eluir compuestos polares que están fuertemente retenidos en el modo de fase normal [o débilmente retenidos en el modo de fase reversa]. El agua, un eluyente muy polar, compite eficazmente con los analitos polares por la fase estacionaria. La HILIC se puede analizar en modo de elución isocrático o en gradiente. Los compuestos polares que inicialmente son atraídos por las partículas del material de relleno polar se pueden eluir a medida que aumenta la polaridad [fuerza] de la fase móvil [añadiendo más agua]. Los analitos se eluyen en orden creciente de hidrofilia [polaridad cromatográfica con respecto al agua]. Se pueden añadir tampones o sales a la fase móvil para mantener los analitos ionizables en una forma única.

Cromatografía de interacción hidrofóbica [HIC]

La HIC es un tipo de cromatografía de fase reversa que se utiliza para separar biomoléculas grandes, como las proteínas. Por lo general, es preferible mantener estas moléculas intactas en una solución acuosa, evitando el contacto con eluyentes orgánicos o superficies que puedan desnaturalizarlas. La HIC aprovecha la interacción hidrofóbica de moléculas grandes con una fase estacionaria moderadamente hidrofóbica, p.ej., la sílice [C₄] unida a butilo, en lugar de la sílice [C₁₈] unida a octadecilo. Inicialmente, las concentraciones más altas de sal en el agua favorecerán que las proteínas se retengan [salgan] en el relleno. Las separaciones en gradiente suelen realizarse disminuyendo la concentración de sales. De esta manera, las biomoléculas se eluyen en orden creciente de hidrofobicidad.

Separaciones basadas en la carga: Cromatografía de intercambio iónico [IEC]

En el caso de las separaciones basadas en la polaridad, los elementos semejantes se sienten atraídos por los elementos semejantes y los opuestos pueden repelerse. En la cromatografía de intercambio iónico y otras separaciones basadas en la carga eléctrica, la regla se invierte. Los elementos semejantes se pueden repeler, mientras que los opuestos se atraen entre sí. Las fases estacionarias para las separaciones por intercambio iónico se caracterizan por la naturaleza y la fuerza de las funciones ácidas o básicas en sus superficies y los tipos de iones que atraen y retienen. El intercambio catiónico se utiliza para retener y separar los iones cargados positivamente en una superficie negativa. Por el contrario, el intercambio de aniones se utiliza para retener y separar los iones cargados negativamente en una superficie positiva [consultar la figura T]. Con cada tipo de intercambio iónico, existen al menos dos métodos generales de separación y elución.

Los intercambiadores iónicos fuertes contienen grupos funcionales [p. ej., aminas cuaternarias o ácidos sulfónicos] que siempre están ionizados. Se suelen utilizar para retener y separar los iones débiles. Estos iones débiles pueden eluirse por desplazamiento con una fase móvil que contenga iones que se atraigan con más fuerza a los sitios de la fase estacionaria. Como alternativa, los iones débiles se pueden retener en la columna y después se pueden neutralizar cambiando in situ el pH de la fase móvil, lo que hace que pierdan su atracción y se eluyan.

Los intercambiadores iónicos débiles [p.ej., con funciones de amina secundaria o ácido carboxílico] pueden neutralizarse por encima o por debajo de un cierto valor de pH y perder su capacidad de retener iones por carga. Cuando se cargan, se utilizan para retener y separar los iones fuertes. Si estos iones no pueden eluirse por desplazamiento, los sitios de intercambio de la fase estacionaria se pueden neutralizar, interrumpiendo la atracción iónica y permitiendo la elución de los analitos cargados.

Cuando se neutralizan los intercambiadores iónicos débiles, estos pueden retener y separar especies mediante interacciones hidrofóbicas [fase reversa] o hidrofílicas [fase normal]; en estos casos, la fuerza de elución está determinada por la polaridad de la fase móvil [figura R-1]. Por tanto, se pueden utilizar intercambiadores iónicos débiles para las separaciones en modo mixto [separaciones basadas tanto en la polaridad como en la carga].

La tabla D describe las pautas para las principales categorías de intercambio iónico. Por ejemplo, para retener un analito fuertemente básico [siempre cargado positivamente], utilizar una partícula de fase estacionaria de intercambio catiónico débil a pH> 7; esto asegura una superficie de partículas cargadas negativamente. Para liberar o eluir la base fuerte, bajar el pH de la fase móvil por debajo de 3; esto elimina la carga de la superficie y apaga el mecanismo de retención del intercambio iónico.

Obsérvese que un pK_a es el valor de pH en el que el 50 % del grupo funcional está ionizado y el 50 % es neutro. Para asegurar una superficie de analito o partícula esencialmente neutra o completamente cargada, el pH debe ajustarse a un valor al menos 2 unidades por encima del pK_a, según corresponda [indicado en la tabla D].

No utilizar un intercambiador de cationes fuertes para retener una base fuerte; ambos permanecen cargados y fuertemente atraídos entre sí, lo que hace que la base sea casi imposible de eluir. Solo se puede eliminar sumergiendo el intercambiador de cationes fuerte con una base de la competencia que exhiba una retención aún más fuerte y desplaza el compuesto de interés al ganar la competencia por los sitios de intercambio activo. Este enfoque rara vez es práctico o seguro en HPLC y SPE. [Los ácidos y bases muy fuertes son peligrosos para trabajar y pueden ser corrosivos para los materiales de fabricación utilizados en los sistemas de fluidos de HPLC.]

Separaciones basadas en el tamaño: Cromatografía por exclusión de tamaño [SEC] - Cromatografía por permeación de gel [GPC]

En 1950, Porath y Flodin descubrieron que las biomoléculas podían separarse en función de su tamaño, en lugar de su carga o polaridad, haciéndolas pasar o filtrándolas a través de un polímero de dextrano hidrofílico de porosidad controlada. Este proceso se denominó filtración en gel. Posteriormente, se utilizó un esquema análogo para separar oligómeros y polímeros sintéticos utilizando rellenos de polímeros orgánicos con intervalos de tamaño de poro específicos. Este proceso se denominó cromatografía por permeación de gel [GPC]. Las separaciones similares realizadas con rellenos de sílice de porosidad controlada se denominaron cromatografía por exclusión de tamaño [SEC]. Introducidos en 1963, los primeros instrumentos comerciales de HPLC se diseñaron para aplicaciones de GPC [consultar la referencia 3].

Todas estas técnicas se realizan normalmente en fases estacionarias que se han sintetizado con una distribución del tamaño de poro en un intervalo que permite que los analitos de interés entren o se excluyan de más o menos volumen de poro del relleno. Las moléculas más pequeñas penetran más poros al pasar a través del lecho. Las moléculas más grandes solo pueden penetrar poros por encima de un cierto tamaño, por lo que pasan menos tiempo en el lecho. Las moléculas más grandes pueden quedar totalmente excluidas de los poros y pasar solo entre las partículas, eluyendo muy rápidamente en un volumen pequeño. Las fases móviles se eligen por dos motivos: en primer lugar, son buenos eluyentes para los analitos; y, en segundo lugar, pueden evitar cualquier interacción [basada en la polaridad o la carga] entre los analitos y la superficie de la fase estacionaria. De esta manera, las moléculas más grandes eluyen primero, mientras que las moléculas más pequeñas viajan más lentamente [porque entran y salen de más poros] y eluyen más tarde, en orden decreciente de tamaño en la solución. De ahí la sencilla regla: los grandes salen primero.

Dado que es posible correlacionar el peso molecular de un polímero con su tamaño en solución, la GPC revolucionó la medición de la distribución del peso molecular de los polímeros que, a su vez, determina las características físicas que pueden mejorar o restar valor al procesamiento, la calidad y el rendimiento de los polímeros [cómo distinguir un buen polímero de uno malo].

Conclusión

Esperamos que haya disfrutado de esta breve introducción a la HPLC. Recomendamos leer las referencias y estudiar el Apéndice sobre la nomenclatura de HPLC.