Guía de iniciación a la cromatografía de convergencia

En este capítulo se revisa, en primer lugar, la terminología utilizada en ambas CC y, a continuación, se describen los tipos de muestras y analitos que pueden analizarse con el sistema ACQUITY UPC². Describimos la función de los coeluyentes, los aditivos de la fase móvil y los diluyentes de la muestra, así como los efectos de la presión y la temperatura en la densidad y cómo esto afecta a las separaciones. Por último, presentamos un protocolo genérico para desarrollar un método.

Terminología

Como se describió anteriormente, la CC es como la RPLC, solo que sustituye el eluyente débil (fase móvil A) por CO₂ comprimido en lugar de agua. Los términos convencionales de eluyente, coeluyente o modificador hacen referencia al componente o los componentes líquidos primarios de la fase móvil B, el disolvente de elución. Normalmente, la CC emplea metanol como coeluyente, pero también puede usar otros eluyentes orgánicos como el etanol, isopropanol, el acetonitrilo o combinaciones de los mismos. Un aditivo es una sal o un líquido que se añade al coeluyente en una concentración baja para mejorar la forma de pico y/o la solubilidad del analito. El aditivo también puede influir en la selectividad cromatográfica. Entre los aditivos habituales tenemos la dietilamina, el hidróxido de amonio, el ácido fórmico, el ácido trifluoroacético, el formiato de amonio, el acetato de amonio o pequeñas cantidades de agua. La concentración adecuada depende del aditivo. Por ejemplo, añadir agua por encima del 5 % conlleva el riesgo de que se forme una fase móvil bifásica si el resto de las condiciones del método no se eligen debidamente.

Una de las primeras preguntas que se plantean sobre cualquier nueva metodología analítica es: «¿Es posible analizar una muestra con esta técnica (cromatografía de convergencia)?» La respuesta corta es: si la muestra se puede disolver en un eluyente orgánico, podemos analizarla mediante CC. No hay una respuesta universal a esta pregunta y tendremos que realizar experimentos para confirmarlo. Esta compatibilidad con los eluyentes de inyección orgánicos es muy oportuna, ya que hay muchas técnicas de preparación de muestras que se realizan en eluyentes orgánicos (por ejemplo, la extracción líquido-líquido, la extracción en fase sólida o la precipitación de proteínas). La ventaja de la CC es que estas muestras, en un eluyente orgánico, se pueden inyectar directamente en el sistema ACQUITY UPC² y no necesitan pasar por ningún proceso tedioso de evaporación y reconstitución, lo que sí se suele requerir en la RPLC. El capítulo 5 trata este tema con más detalle. Para un científico analítico, siempre es útil aprender tanto como sea posible sobre una muestra (figura 23). Cuanto mayor el conocimiento, mayor será la probabilidad de desarrollar un método robusto. Existe un dato útil con respecto a la solubilidad de los compuestos en varios eluyentes orgánicos que está relacionado con el coeficiente de partición (P) (generalmente denominado log₁₀ P). El coeficiente de partición (P) es la relación entre las concentraciones de un compuesto en las dos fases de una mezcla de dos eluyentes inmiscibles en equilibrio, normalmente agua y 1‑octanol (figura 24). Estos coeficientes son una medida de la solubilidad diferencial del compuesto entre estos dos eluyentes. El coeficiente de partición mide cuán hidrofílico o hidrofóbico es un compuesto.

En cuanto a la CC, el coeficiente de partición podría ayudar a determinar si un compuesto diana se puede analizar con el sistema ACQUITY UPC². Por regla general, los compuestos con valores de log P entre 2 y 9 son analizables mediante CC.

Los coeluyentes en la cromatografía de convergencia

El coeluyente desempeña dos funciones. Por un lado, influye en el poder de solvatación del CO₂. Por el otro, influye en la interacción entre el analito y la fase estacionaria. Cambiar el coeluyente (de metanol a acetonitrilo, por ejemplo) afecta tanto a la retención como a la selectividad. La función del coeluyente en la CC es análoga a la del eluyente fuerte en la LC de fase reversa: el CO₂ tiene por sí mismo aproximadamente la fuerza de elución del heptano.

La tabla 1 del capítulo 1 muestra la serie eluotrópica de eluyentes (fuerza de elución) para diferentes eluyentes orgánicos y resalta los cuatro coeluyentes más comunes utilizados en la CC: acetonitrilo, isopropanol, etanol y metanol. Todos los eluyentes enumerados son miscibles con CO₂, lo que ofrece muchas opciones de fuerzas de retención y elución.

Los coeluyentes añadidos a la fase móvil de CO₂ suelen reducir el tiempo de retención de un analito. Cuando aumenta la concentración del coeluyente, la polaridad de la fase móvil cambia, disminuyendo así el tiempo de retención. La figura 25 ilustra el efecto de cambiar la concentración de coeluyente sobre la retención en una separación isocrática. La retención de analitos aumenta a medida que disminuye la concentración del coeluyente fuerte de elución (metanol). Este es el mismo fenómeno que se observa en la RPLC.

La figura 26 muestra cómo cambia la fuerza de la fase móvil con diferentes coeluyentes. El metanol es el coeluyente más fuerte y es el que eluye los analitos más rápido. El isopropanol es más débil que el metanol, pero más fuerte que el acetonitrilo, mientras que el acetonitrilo es el más débil de los tres coeluyentes en la CC, aunque retiene los analitos durante más tiempo. El mismo tipo relativo de comportamiento cromatográfico se produce en otros modos de cromatografía: los eluyentes más fuertes disminuyen la retención y eluyen los analitos más rápido.

Se pueden mezclar diferentes coeluyentes en la CC, cambiando la fuerza del eluyente y creando diferencias en la retención. La figura 27 ilustra el efecto de añadir un coeluyente más débil (acetonitrilo) al metanol, para una separación por gradiente de metoclopramida y sus impurezas relacionadas. A medida que aumenta la concentración de acetonitrilo, disminuye la concentración de metanol y, por lo tanto, la fuerza del eluyente. También se observan tiempos de retención más largos. Las pequeñas modificaciones en la selectividad, la resolución mejorada y los picos se agudizan con un coeluyente diferente para esta separación.

Los aditivos en la cromatografía de convergencia

Al igual que en la RPLC, los aditivos en la CC mejoran la forma de pico y/o la resolución de la separación. En la figura 27 se muestran los efectos de añadir formiato de amonio a todas las mezclas de coeluyentes para los cuatro cromatogramas. Los aditivos pueden modificar la superficie de la fase estacionaria o actuar como pares iónicos, modificando la selectividad. Los aditivos básicos tienden a mejorar la forma de pico de los compuestos básicos y pueden modificar levemente la selectividad. Algunos ejemplos de aditivos básicos son el hidróxido de amonio, la 2-propilamina y la trietilamina. Los aditivos ácidos pueden mejorar la forma de pico de los compuestos ácidos y pueden modificar la selectividad. Entre los aditivos ácidos comunes, encontramos el ácido trifluoroacético, el ácido fórmico y el ácido acético. La figura 28 muestra una separación de analitos ácidos y, como muestra este ejemplo, al aumentar la concentración del aditivo ácido, se mejora la forma de pico.

Cambiar entre diferentes aditivos puede tener un efecto drástico en la forma y la retención de los picos (figura 29). Para estos analitos básicos (betabloqueantes), un coeluyente de metanol sin aditivo da lugar a una forma deficiente de picos. Añadir ácido fórmico empeora la forma de pico. El ácido fórmico también absorbe a la longitud de onda de detección de 220 nm, lo que da como resultado una línea base inclinada. Para estas bases fuertes, añadir acetato de amonio (20 mM) mejora drásticamente la forma de pico, al igual que la dietilamina, ya que la forma de pico del compuesto básico suele mejorar al utilizar aditivos básicos.

Los diluyentes de muestras en cromatografía de convergencia

Aunque haya diferentes diluyentes de muestra compatibles con la CC, a veces es necesario seleccionar el diluyente más idóneo para lograr la mejor forma de pico. En la CC, la concentración del diluyente de la muestra puede afectar considerablemente a la forma de pico y a la solubilidad. Al igual que con otros modos de cromatografía, se recomienda un diluyente de muestra lo más suave posible para equilibrar la solubilidad del analito y la forma de pico. En la CC, eso significa que la muestra debe disolverse en un eluyente orgánico casi en la parte superior de la serie eluotrópica (tabla 1). Se recomienda heptano/2-propanol (90:10) como eluyente genérico para equilibrar la solubilidad (isopropanol) y la forma de pico (heptano). El contenido de agua en la muestra debe reducirse o, si es posible, eliminarse. La figura 30 muestra siete cromatogramas superpuestos de picos para el butilparabeno, un compuesto neutro. A medida que aumenta el volumen de inyección, aparecen los efectos de la concentración del eluyente de inyección sobre la forma de pico. En el caso del metanol como coeluyente fuerte, se producen picos con frente a medida que aumenta el volumen de inyección. El isopropanol, que es más débil, muestra picos con menos frente y ligeramente más altos en comparación con el metanol. El diluyente de muestra recomendado, el isopropanol/hexano, garantiza picos agudos y simétricos para todos los volúmenes de inyección.

Presión, temperatura y densidad

La configuración del regulador automático de contrapresión (ABPR) afecta al tiempo de retención al modificar la densidad del CO₂ comprimido. A medida que aumenta el ajuste de presión de ABPR, la densidad aumenta, mientras que los tiempos de retención disminuyen. A pesar de que la composición de la fase móvil es lo que más influye en la separación, ajustar la presión y la densidad de la fase móvil puede optimizar un método. La figura 31 muestra que aumentar el ajuste de ABPR (presión) y dejar todos los demás parámetros sin modificar da como resultado tiempos de retención más cortos.

 Al igual que en la RPLC, la temperatura de la columna afecta tanto a la selectividad como a la retención en la CC, y los diferentes analitos se ven afectados en distintos grados. Al aumentar la temperatura de la columna, aumenta la energía de las moléculas de analito, lo que, como ocurre en la LC o la GC, debería reducir la retención en las fases estacionarias. Sin embargo, aumentar la temperatura a presión constante en la CC también disminuye la densidad de la fase móvil, lo que reduce su poder de solvatación y, por lo tanto, conlleva una mayor retención. Por lo tanto, en la CC, variar la temperatura tiene un efecto de neutralización. Generalmente, a medida que aumenta la temperatura de la columna, disminuye la densidad de la fase móvil y aumentan los tiempos de retención (figura 32). Además, hay que tener en cuenta la presencia de un pequeño pico adicional a 50 °C, que se debe a ligeras diferencias de selectividad, ya que la temperatura afecta a diferentes analitos de distintas maneras.

La forma, la retención y la selectividad de los picos se manipulan variando y comprendiendo las funciones del coeluyente, el aditivo, el diluyente de la muestra, la presión, la temperatura y la fase estacionaria. Resumiendo todo lo explicado en este capítulo, la tabla 5 muestra cómo se optimizan las separaciones mediante CC con estas herramientas. Sin embargo, hay que tener en cuenta que, para una separación determinada, la importancia de cada parámetro puede variar. Por ejemplo, a veces la fase estacionaria desempeña una función más importante que el coeluyente elegido al manipular la selectividad. En otras situaciones, cambiar de metanol a metanol/acetonitrilo 50:50 resulta más significativo que modificar la composición química de la columna.

Protocolo de desarrollo de métodos genérico: enfoque 1

La figura 33 describe un protocolo para determinar rápidamente si una muestra se puede disolver en un eluyente de inyección compatible con la CC. Si el log P del analito tiene un valor entre -2 y 9, sí se puede disolver. Si es menor que -2, el analito solo es soluble en un eluyente acuoso y, por lo tanto, puede no ser compatible con la CC. Si se desconoce el valor de log P del analito, debe disolverse en un eluyente orgánico adecuado antes de inyectarlo. Hay que recordar que la cromatografía de convergencia se asemeja más a una separación de fase normal, en la que los eluyentes como el metanol son muy fuertes (lo contrario ocurre en una LC de fase reversa, que emplea un eluyente bastante débil).

En consecuencia, la muestra debe disolverse (o diluirse) en un eluyente más suave, como heptano/isopropanol. El objetivo es lograr un equilibrio entre la solubilidad de la muestra y la forma de pico. Más arriba en el presente capítulo, se encuentra un análisis del efecto del diluyente de la muestra sobre la forma de pico en la CC.

Además de seleccionar un diluyente de la muestra, se deben considerar otros factores al desarrollar un método. Por ejemplo, ¿qué condiciones cromatográficas son adecuadas para el analito en cuestión? La figura 34 muestra un conjunto genérico recomendado de condiciones iniciales capaces de retener y separar diferentes analitos. Como ocurre en cualquier modo de cromatografía, estas condiciones no son apropiadas en todos los casos y se pueden emplear estrategias para mejorar la forma de pico, así como de modificar la selectividad y la retención.

Para tales casos, las figuras 35, 36 y 37 muestran los enfoques sistemáticos para mejorar la forma de pico, modificar la retención y alterar la selectividad. No son tan diferentes de los que se utilizan en la LC de fase reversa. La figura 35 presenta un protocolo para mejorar la forma de pico. El punto de partida inicial es un conjunto de condiciones recomendadas en función de si los analitos de interés son de naturaleza esencialmente básica o ácida. Los compuestos ácidos tienden a tener una mejor forma de pico en condiciones ácidas, como pasa con los compuestos básicos en condiciones básicas. Como estrategias para mejorar la forma de pico, podemos probar con un aditivo diferente, cambiar la concentración del aditivo y cambiar la composición química de la columna.

La figura 36 muestra un protocolo para aumentar la retención. Al igual que con cualquier forma de cromatografía líquida, la primera opción es utilizar un coeluyente diferente (más débil). El metanol es el coeluyente más fuerte utilizado en CC. El uso de un coeluyente más suave, como el acetonitrilo u otro alcohol, aumenta el tiempo de retención en la columna. También puede resultar efectivo aplanar o reducir la pendiente del gradiente, disminuyendo el porcentaje final de coeluyente o aumentando la duración del gradiente. La mezcla de coeluyentes y la reducción de la concentración de metanol debilitarán la fuerza general de los coeluyentes, lo que aumentará la retención. La capacidad de manipular la densidad de la fase móvil en la columna es una propiedad exclusiva de la SFC y la CC. Esto modifica la retención general, ya que una menor densidad equivale a una mayor retención. Esto se logra disminuyendo el ajuste del ABPR y/o aumentando la temperatura. Finalmente, otra estrategia para aumentar la retención es usar una química de columna diferente.

La figura 37 ilustra un protocolo para modificar la selectividad (orden de elución, retención relativa) de la separación. Un posible enfoque es probar diferentes coeluyentes, como el acetonitrilo en lugar del metanol. El cambio de un coeluyente prótico a base de alcohol a un coeluyente aprótico no alcohólico, como el acetonitrilo, tiene un efecto mucho mayor sobre la selectividad que el cambio de metanol a otro alcohol. Puesto que una reducción en la concentración de metanol debilita la fuerza general del coeluyente, esto puede aumentar la retención y modificar la selectividad. Manipular la densidad de la fase móvil también puede cambiar la retención general del analito, ya que estos efectos de densidad pueden variar en analitos específicos, lo que podría optimizar una separación determinada. Por último, este protocolo recomienda, si es necesario, una química de columna diferente.

Protocolo de estrategia de desarrollo de métodos de familias de columnas: método 2

El protocolo de desarrollo de métodos descrito en la sección anterior se centra en las condiciones de inicio genéricas y el impacto de las propiedades variables de la fase móvil para optimizar una separación. En esta sección se describen otras dos alternativas: una para la separación quiral y la otra para la aquiral. Ambas alternativas requieren combinaciones de una columna y un método que tenga estadísticamente la mayor tasa de éxito para un gran grupo de compuestos de prueba diversos. En general, se usa la aproximación de «fuerza bruta» (todas las opciones posibles) durante la selección de la columna en la CC, aunque los protocolos sugeridos en esta sección proponen una estrategia paso por paso.

Estrategia de desarrollo de métodos para separaciones quirales con columnas UPC² Trefoil

El protocolo de cribado sugerido para compuestos quirales se basa en tres químicas quirales UPC² Trefoil de Waters: AMY1, CEL1 y CEL2. El protocolo de cribado que aparece en la figura 38 recomienda seguir un proceso de cribado de cuatro pasos y cuatro columnas, así como mezclas de coeluyentes optimizadas para tener las mayores probabilidades de éxito.

Según este protocolo, se debe iniciar el cribado con el AMY1, utilizando una mezcla a partes iguales de etanol, isopropanol y acetonitrilo con 20 mM de acetato de amonio. Si el método no logra la separación deseada, el siguiente método debe emplear la columna CEL1 con una mezcla a partes iguales de metanol e isopropanol con un 0,2 % de ácido trifluoroacético (TFA), y así sucesivamente. Las condiciones detalladas del método se presentan en el cuadro de la figura 38.

Estrategia del desarrollo de métodos para separaciones aquirales con columnas UPC² Torus

El protocolo de cribado para una separación aquiral sigue un enfoque similar. Se puede lograr en un máximo de tres pasos, descritos a continuación:

Paso 1

Comenzar con una exploración rápida utilizando una columna Torus 2-PIC (3,0 × 100 mm) y las siguientes condiciones cromatográficas: 1,2 mL/min, 4‑50 % de MeOH en 3 min, 30 °C, BPR a 2000 psi.

En función de los resultados obtenidos, observar si:

1. a) Se cumplen los requisitos de selectividad y forma de pico. Después, optimizar aún más el método solamente si es necesario.
2. b) Se consigue una buena selectividad, pero la forma de pico tiene que mejorar. Para ello, utilizar una columna Torus 2-PIC con un aditivo (ácido fórmico para los ácidos o un aditivo básico para las bases).
3. c) Si los datos muestran que se necesita una selectividad diferente, saltar al paso 2.

Paso 2

Según la naturaleza de la muestra, elegir la ruta adecuada descrita en el cuadro de cribado definido (Defined Screening). A continuación, seguir los pasos utilizando la combinación sugerida de columna y coeluyente hasta lograr una separación adecuada.

Paso 3

Para optimizar la separación, se puede ajustar la composición del coeluyente del método, la temperatura, el aditivo y la presión. Las figuras de la sección 4.7 muestran cómo optimizar un método de esta manera.