Guía de iniciación a la cromatografía de convergencia

Como vimos en el capítulo anterior, la CC se parece mucho a la LC desde el punto de vista de las separaciones. Incluso desde el punto de vista del instrumento, la CC se parece a un sistema de LC (ver la figura 7) en todos los aspectos, excepto por un componente adicional, el ABPR, que presuriza todo el sistema por encima de un punto de ajuste. Para aprovechar las ventajas de la fase móvil basada en CO₂ y otorgarle los beneficios de la UPLC moderna, Waters modificó su sistema ACQUITY UPLC de baja dispersión y con tolerancia a la presión, haciendo que los componentes clave del sistema fueran compatibles con un eluyente compresible como el CO_2. La modificación más notable fue la inclusión de la bomba de CO₂ licuado para medir el flujo a través del sistema de CC. Aunque el CO₂ se licúa primero (a 13 °C, por ejemplo), es casi tres veces más compresible que el metanol o el acetonitrilo. Por lo tanto, la bomba tuvo que ser modificada para una cromatografía de convergencia reproducible.

Desafíos de los sistemas de SFC analíticos anteriores

Históricamente, era bien sabido que los sistemas de SFC analíticos eran poco fiables. Todos ellos eran sistemas de LC reconvertidos. Las bombas, los inyectores y los detectores diseñados para la LC no estaban diseñados para funcionar con CO₂ comprimido.

Las bombas de LC recíprocas de una sola etapa no podían comprimir ni suministrar CO₂ de forma exacta, repetida y fiable. No están diseñados para funcionar con un líquido tan compresible como el CO₂, que provoca caudales másicos y composiciones de masas variables en la fase móvil. Esto cambia el poder de solvatación de la fase móvil y, normalmente, se manifiesta en forma de cambios en los tiempos de retención de una inyección a otra o de un sistema a otro.

Las fases móviles de CO₂ altamente compresible también comprometen la sensibilidad analítica debido al ruido generado por la bomba y el regulador de contrapresión. Además, dados los importantes problemas de exactitud y precisión deficientes al utilizar inyecciones de bucle parcial, los instrumentos de HPLC reconvertidos a menudo están restringidos a inyecciones de bucle completo, lo que limita las opciones de volúmenes de inyección. En cuanto a los sistemas, los de HPLC reconvertidos presentan un volumen de dispersión del sistema significativamente mayor, lo que causa una dispersión de banda no deseada y no es posible utilizar columnas de partículas de 1,7 µm más eficientes. Estos inconvenientes limitan en gran medida la capacidad potencial y el rendimiento alcanzable de un sistema de LC reconvertido basado en CO₂.

A continuación, revisaremos las innovaciones realizadas en cada módulo individual del sistema ACQUITY UPC² (figura 7).

Tecnología de gestión de eluyentes: la bomba

Para garantizar el control exacto y preciso de los caudales y la composición de la fase móvil, es necesario observar toda la trayectoria del flujo del sistema. Como hemos señalado anteriormente, las bombas de HPLC reconvertidas , diseñadas para comprimir y suministrar simultáneamente y con exactitud el volumen especificado de eluyente, no son capaces de manipular un fluido tan compresible como el CO₂ líquido. En algunos instrumentos de SFC, el CO₂ entrante pasa a través de un dispositivo de precompresión y enfriamiento. Este dispositivo se encuentra junto al sistema cromatográfico (figura 8). Cuanto más lejos esté este dispositivo de la bomba, más difícil será controlar con exactitud el caudal másico de CO₂, ya que la densidad del CO₂ puede cambiar entre el paso de precompresión y el de bombeo, dependiendo de la temperatura ambiente. Además, los algoritmos de bombeo (software de control interno) de los sistemas de SFC tradicionales, generalmente diseñados para suministrar líquidos relativamente incompresibles, tienen dificultades para mantener la exactitud y la precisión de la composición y la reproducibilidad del tiempo de retención. Se producen los mismos problemas al intentar suministrar de forma fiable porcentajes bajos de coeluyente (menos del 5 %), lo que dificulta el análisis de mezclas con polaridad diversa.

Por el contrario, el sistema de gestión de eluyentes binario (BSM) del ACQUITY UPC² de Waters está diseñado específicamente para gestionar fluidos compresibles con un dispositivo de precompresión totalmente integrado. Esto garantiza un control excepcional del caudal másico y la composición de la masa, lo que da como resultado tiempos de retención fiables y reproducibles, y un ruido casi nulo de la línea base. Como se indicó anteriormente, en un sistema de fluido compresible, la densidad del eluyente controla el poder de solvatación de la fase móvil, por lo que es fundamental un control preciso para su reproducibilidad. Los algoritmos de control independientes, esenciales para los componentes líquidos compresibles y no compresibles, mezclan con exactitud diferentes composiciones de fase móvil, incluidos los porcentajes bajos de coeluyente (figura 9), y proporcionan perfiles de gradiente reproducibles (figura 10).

Los sistemas de SFC analíticos nunca antes habían logrado niveles de control tan precisos, especialmente en las separaciones por gradiente. El sistema ACQUITY UPC² está diseñado para controlar con precisión la entrada, la compresión y el suministro de la bomba, lo que le otorga la reproducibilidad que se espera de una LC Ultra Performance. El control de densidad volumétrica utilizado en el BSM del sistema ACQUITY UPC² supera el control de flujo másico, lo que proporciona una precisión cromatográfica excepcional. Gracias a esto, se consiguen tiempos de elución controlados y un control excepcional de la fuerza de solvatación. Los propios cabezales de la bomba se refrigeran de forma independiente, lo que mejora el control de la densidad del CO₂ y, por lo tanto, el suministro exacto de masa. La bomba y los algoritmos de compresión integrados son tan eficaces y el control es tan preciso que se puede utilizar CO₂ líquido o gaseoso como fase móvil inicial. La figura 11 muestra el funcionamiento interno del BSM. La bomba de coeluyente es una bomba de UPLC, mientras que la bomba de CO₂ está detrás de la cubierta negra aislante. Puesto que el dispositivo de compresión y enfriamiento es una parte integral de la bomba, esta cubierta aislante permite un control más preciso de la densidad del CO₂ entrante.

Inyección de muestras

Los sistemas de SFC analíticos tradicionales, ya utilicen inyectores de bucle completo o de bucle parcial, tienen dificultades para inyectar de forma reproducible volúmenes bajos de muestra. En la mayoría de los casos, solo se pueden hacer inyecciones de bucle completo. Con inyecciones de bucle parcial es difícil mantener la homogeneidad del eluyente de inyección. Por esta razón, la exactitud, la precisión y la linealidad se ven perjudicadas, lo que impide la cuantificación del analito. Se pueden desperdiciar grandes cantidades de muestra con cada inyección, por lo que muy a menudo se debe cambiar manualmente un bucle de muestras cuando sea necesario, lo que limita la flexibilidad del sistema.

El sistema de gestión de muestras del ACQUITY UPC² tiene un nuevo diseño de válvula de inyección doble (figura 12). Esto hace que el bucle de muestra principal se evacúe a residuos, permitiendo que la muestra entre en el bucle bajo presión atmosférica y, al mismo tiempo, manteniendo la homogeneidad de la fase móvil. Además, la válvula de inyección auxiliar se diseñó para reducir los pulsos de presión de la secuencia de inyección y mitigar el arrastre, lo que permite inyecciones de bucle parcial repetibles y reproducibles (figura 13). Se pueden realizar inyecciones de 0,1 a 50 μL en incrementos de 0,1 μL y, con las opciones de lavado con doble aguja, el arrastre de muestras es casi nulo. La figura 14 muestra la linealidad de la inyección con una inyección de bucle parcial de 1 a 10 µL en incrementos de 1 µL.

Detección óptica

La detección óptica a veces es problemática con los sistemas de SFC analíticos. Las celdas de flujo del detector diseñadas para sistemas de HPLC pueden producir un volumen de dispersión y un ruido en la línea base inaceptables. Los detectores de índice de refracción, cuando se utilizan para SFC, causan un ruido y una curvatura importantes en la línea base al usar un líquido compresible, lo que amplifica el ruido producido por el sistema de bombeo. Los eluyentes como el metanol y el agua, que se utilizan habitualmente en la RPLC, tienen valores de índice de refracción muy similares (figura 15), por lo que los efectos IR en los métodos de fase reversa no suelen ser tan significativos. El CO₂ tiene un valor muy diferente al del metanol (el coeluyente más utilizado), lo que hace que el intervalo de índices de refracción de las sustancias sea mayor que en la LC, lo que aumenta el ruido en la línea base y limita la sensibilidad. Otro problema es el de la densidad (y el índice de refracción, por tanto) de una fase móvil basada en CO₂, que cambia en el transcurso de un análisis por gradiente.

El detector ACQUITY UPC² PDA está diseñado específicamente para fluidos compresibles. En lugar de lentes de zafiro, que reducen el flujo de energía a longitudes de onda UV más bajas, las lentes del detector ACQUITY UPC² PDA están hechas de sílice de alta resistencia que aguanta la contrapresión generada durante una separación. Esto ayuda a maximizar la sensibilidad, reducir el ruido en la línea base y compensar las diferencias en los efectos del índice de refracción entre el CO₂ y el coeluyente orgánico. El sistema óptico se controla térmicamente para mejorar aún más la estabilidad en la línea base y mitigar los efectos del índice de refracción. Una celda de flujo de acero inoxidable de baja dispersión admite anchos de pico estrechos, mientras que el camino óptico de 10 mm maximiza la sensibilidad y, al mismo tiempo, mantiene un rendimiento espectral óptimo. El nivel excepcional de sensibilidad que se puede obtener permite cuantificar las impurezas a nivel de trazas (figura 16).

Detección por espectrometría de masas (MS)

Al igual que los requisitos únicos del instrumento para adaptar la detección óptica de la fase móvil compresible de la CC, la interfaz de CC y MS requiere modificaciones para adaptarse a la compresibilidad de la fase móvil. La interfaz CC-MS debe permitir que la fase móvil se descomprima del estado presurizado a la presión atmosférica dentro de la fuente de iones de los espectrómetros de masas actuales. Sin la debida consideración de la compresibilidad de la fase móvil, el transporte de analitos a la fuente de iones puede verse afectado negativamente. Un transporte deficiente de analitos puede dar lugar a una forma de pico y/o una ionización deficientes. En el peor de los casos, no se producirá la ionización y el espectrómetro de masas no detectará el analito de interés.

La descompresión de la fase móvil comprimida debe controlarse independientemente del caudal de la fase móvil, de la composición de la fase móvil y de la presión del sistema poscolumna establecida por el regulador de contrapresión automatizado (ABPR). Además, se debe llevar a cabo la descompresión sin renunciar al transporte eficaz de analitos a la fuente de iones. Para lograr estos objetivos, la interfaz de espectrometría de masas ACQUITY UPC² se diseñó para una fase móvil compresible y emplea una interfaz de flujo dividido con un líquido auxiliar. La interfaz de espectrometría de masas introduce un caudal constante de fase móvil, normalmente entre 300 y 500 µL/min (comprimido), a través del limitador de división hasta el espectrómetro de masas. La parte restante de la fase móvil se dirige al ABPR para controlar la presión del sistema poscolumna en una amplia gama de caudales y composiciones de la fase móvil. En la figura 17 se muestra una representación esquemática de la interfaz de espectrometría de masas del ACQUITY UPC², que pone de relieve la interfaz dividida y la adición de líquido auxiliar.

El líquido auxiliar en la interfaz CC-MS tiene múltiples funciones. Principalmente, se requiere para la operación de ionización por electrospray (ESI) con un modificador del 5 % aproximadamente. Debido a que la ESI es una técnica de ionización en fase líquida, se requiere cierta cantidad de líquido para la ionización. Por consiguiente, cuando el porcentaje de modificador de la fase móvil es muy bajo, la cantidad de líquido presente en la fase móvil es insuficiente para la ESI. Así pues, se requiere la adición de líquido en forma de flujo auxiliar para la ESI a porcentajes bajos de modificador. Por otra parte, el líquido auxiliar puede ayudar con el transporte de analitos. En algún punto a lo largo del limitador de división, el CO₂ pasará del estado denso a alta presión al estado gaseoso y perderá su poder de solvatación. En consecuencia, una vez el CO₂ se haya transformado en gas, solo el modificador líquido estará disponible para disolver los analitos y transportarlos a la fuente de iones. Cuando se emplean porcentajes de modificador nulos o muy bajos en la separación, no hay líquido disponible para transportar los analitos a través del limitador de división hasta la fuente de ionización. El líquido auxiliar se añade a contracorriente del limitador de división para ayudar a transportar los analitos a la fuente de iones en tales condiciones. En la figura 18 se muestra un ejemplo de perfiles de picos que indican un transporte de analito deficiente y uno óptimo. En este caso, el caudal del líquido auxiliar se seleccionó para un transporte deficiente (18A) y efectivo (18B) de analitos.

El líquido auxiliar también es importante para transportar analitos cuando estos tienen una solubilidad limitada en el modificador líquido de la fase móvil. A veces, el analito es altamente soluble en la mezcla de modificador líquido y dióxido de carbono comprimido, pero menos soluble cuando está solamente en el modificador líquido. En estos casos, el analito puede precipitar a partir de la solución una vez pase el CO₂ a estado gaseoso en el limitador de división, incluso cuando haya altos porcentajes de modificador líquido presente. Cuando la solubilidad del analito en el modificador líquido es insuficiente, obtenemos como resultado una forma de pico desfavorable, una obstrucción del tubo de la interfaz y/o poca reproducibilidad de los picos. Añadir un líquido auxiliar adecuado puede ayudar a evitar estas dificultades al aumentar la solubilidad del analito en la mezcla de modificador líquido y líquido auxiliar recién formada. Por ejemplo, los analitos altamente lipofílicos pueden ser altamente solubles en una fase móvil de CO₂/metanol y relativamente insolubles en solamente metanol. En este caso, se puede añadir un líquido auxiliar apolar para reducir la polaridad neta del modificador líquido y la mezcla del líquido auxiliar. El analito lipófilo será más soluble en la mezcla líquida de baja polaridad y, por lo tanto, se transportará más fácilmente a la fuente de iones.

Cuando es necesario, los fluidos auxiliares en la interfaz CC-MS también introducen compuestos que mejoran la ionización en el espectrómetro de masas. Estos compuestos se pueden añadir tras la columna, sin que la separación se vea afectada. Los compuestos que mejoran la ionización, como el 5 % (en volumen) de agua y/o 20 mM de hidróxido de amonio, ácido fórmico o acetato de amonio, pueden a menudo aumentar la eficacia de ionización por ESI. La concentración y el tipo de compuesto potenciador de la ionización son muy específicos del analito y deben ajustarse a cada aplicación para obtener una respuesta óptima.

Una vez que se selecciona la composición del líquido auxiliar, también se puede ajustar su caudal para garantizar también una respuesta óptima. Se puede comparar diferentes caudales con la respuesta de MS. Un caudal demasiado bajo puede dar lugar a un transporte deficiente, mientras que un caudal auxiliar demasiado alto a menudo da como resultado una señal MS reducida. Junto con la composición del líquido auxiliar, el caudal óptimo del líquido auxiliar depende de los métodos y los analitos. Si se desea una respuesta de señal máxima, se deben optimizar con cada nueva aplicación. Además, la composición del fluido auxiliar y el caudal deben volver a optimizarse al cambiar entre técnicas de ionización; por ejemplo, al cambiar de ESI a ionización química a presión atmosférica (APCI).

En resumen, la interfaz de espectrometría de masas para ACQUITY UPC² se ha diseñado específicamente para una fase móvil compresible y para interactuar con un espectrómetro de masas moderno que emplee técnicas de ionización a presión atmosférica como ESI, APCI, ionización multimodo ESCi, fotoionización a presión atmosférica (APPI) y UniSpray.

Regulación de contrapresión

Una de las partes esenciales de cualquier sistema es la gestión de eluyentes compresibles, que es la capacidad de controlar y mantener con exactitud la presión que hay dentro del sistema. Como hemos visto, un control impreciso de la contrapresión puede afectar en gran medida a la densidad de la fase móvil y, por lo tanto, a los tiempos de solvatación y retención del analito. Los sistemas de SFC tradicionales suelen tener un control inexacto e impreciso de la contrapresión debido a múltiples factores como: un control deficiente de la presión en el regulador de contrapresión (ABPR), bucles de retroalimentación de respuesta lenta, motores paso a paso de baja resolución, un control deficiente de la presión y del flujo en la bomba, y la degradación con el paso del tiempo de los componentes de ABPR.

El sistema ACQUITY UPC² muestra un mejor control de la contrapresión a través de un innovador BPR activo y estático de dos etapas (figura 19). Mediante esta combinación de control de contrapresión activo y estático, el BPR estático mantiene el sistema a una presión mínima, mientras que el BPR activo mejora el control del punto de ajuste definido por el usuario (figura 20). En un esfuerzo por mejorar aún más su robustez, se calienta el cartucho BPR estático para mitigar el riesgo de congelación de la fase móvil, que puede ocurrir con la descompresión rápida en la salida del ABPR. El BPR de dos etapas se encuentra dentro del gestor de convergencia (CM) del ACQUITY UPC² (figura 21). Este módulo también aloja el filtro de partículas en línea para el CO₂ entrante y el detector de fugas de CO₂, así como la válvula de purga, la de liberación de presión y la de inyección auxiliar.

Rendimiento general del sistema

Para finalizar, al igual que los sistemas ACQUITY UPLC, el sistema ACQUITY UPC² tiene una dispersión inherentemente baja, lo que permite el uso de un diámetro interno más pequeño y de columnas de partículas de menor tamaño (figura 22). Las columnas de diámetro interno estrecho aumentan la sensibilidad, ahorran eluyente y utilizan caudales más adecuados para la espectrometría de masas. Las columnas de partículas de menor tamaño aumentan la eficacia de la separación y mejoran la resolución.