주입 부피 증가에 따른 피크 모양 변화

이 시리즈를 통해 논의한 바와 같이, 피크 모양의 변화는 HPLC 분석에서 흔히 발생하는 문제입니다. 피크는 가우스 모양에 따라 대칭을 이루는 것이 이상적입니다 [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353–362]. 피크의 대칭성은 그림 1에 표시된 것처럼 USP 테일링 인자(T)의 계산을 통해 정량화할 수 있습니다. 테일링 인자가 1이면 완벽한 대칭성을 나타내며, 1보다 작은 값은 프론팅, 1보다 큰 값은 테일링이라고 합니다. 많은 분석법에서는 모든 피크의 테일링 인자가 지정된 범위 내에 있어야 합니다. 테일링 인자가 1에서 크게 벗어날 경우 서로 가까이 용리되는 피크의 분리능을 감소시켜 피크의 적분을 더 어렵게 만들 수 있습니다 [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353–362]. 또한 피크의 대칭성이 좋지 않은 경우, 피크가 실제보다 더 넓어져 피크의 높이가 감소하는 경우가 많습니다. 저농도로 존재하는 분석 물질의 검출 및 정량화와 관련된 응용 분야에서, 이는 결과의 정밀도와 정량화 및 검출 한계의 저하로 이어집니다.

저농도로 존재하는 분석 물질을 정량화하는 분석법을 개발할 때 중요한 단계는 주입 부피를 최적화하는 것입니다. 피크 높이와 피크 면적은 질량, 부피 또는 검출기 과부하가 발생하기 전까지 고정된 샘플 조성의 주입 부피에 따라 선형으로 증가하는 것이 이상적입니다 [U. D. Neue, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice, Wiley-VCH, New York, 1997, pp. 355–356]. 그림 2A의 예에서는 각각 0.2µg/mL 농도의 6가지 분석 물질로 구성된 혼합물을 5~95%에 해당하는 아세토니트릴 기울기를 사용하여 분리했습니다. 주입 부피는 2µL이며 2.1 x 50mm 컬럼이 사용되었으므로, 주입 부피는 컬럼 부피의 1.1%입니다. 일반적인 지침에 따르면 주입 부피는 컬럼 부피의 1~10%에 해당해야 하므로 [Waters 지식 클라우드 48961], 신호 대 잡음비를 높이기 위해 주입 부피를 늘릴 여지가 있는 것으로 보입니다. 주입 부피를 4µL로 늘렸을 때, 그림 2B에 표시된 크로마토그램을 얻을 수 있었습니다. 예상대로 6개 피크의 면적은 모두 2배로 증가했지만, 처음 두 피크는 높이가 증가하지 않았습니다. 단, 피크의 너비가 증가하며 프론팅이 뚜렷해졌습니다.

처음 두 부분에서 논의한 바와 같이, HPLC 시스템, 이동상, 샘플, 컬럼 문제를 포함하여 피크의 대칭성에 변화를 유발하는 요소는 몇 가지가 존재합니다 [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385–420]. 앞서 논의한 바와 같이, 문제 해결을 위한 좋은 출발점은 크로마토그램을 주의 깊게 분석하여 피크 모양의 변화가 모든 피크에서 나타나는지 혹은 일부 피크에서 나타나는지 관찰하는 것입니다. 그림 2B와 같이 크로마토그램의 일부 피크에만 프론팅 피크가 나타나는 경우, 이에 대한 원인으로는 간섭 화합물의 동시 용리, 질량 과부하, 너무 강한 샘플 용매의 사용 등을 들 수 있습니다.주입 부피를 늘린 후에 문제가 관찰되었고 분석 물질의 농도가 낮았으므로, 후자의 원인이 가장 유력해 보입니다. 그림 2A 및 2B에 표시된 크로마토그램에서 사용된 샘플 용매는 50/50 v/v 아세토니트릴/물입니다. 해당 용매가 선택된 이유는 일부 분석 물질은 물에 대한 용해도가 제한적이기 때문입니다. 기울기가 시작될 때 아세토니트릴 농도는 5%에 불과하므로, 샘플 용매는 초기 이동상에 비해 상당히 강합니다. 가장 먼저 용리되는 분석 물질은 소수성이 가장 낮기 때문에, 강한 샘플 용매의 영향을 가장 많이 받습니다. 이 가설을 검증하기 위해, 분석 물질 농도는 동일하지만 아세토니트릴/물의 비율이 다른 일련의 샘플을 준비했습니다. 처음 두 피크에 대한 테일링 인자의 계산 결과는 그림 3에 나와 있습니다. 아세토니트릴의 농도가 증가함에 따라 두 분석 물질의 테일링 인자는 감소하는데, 이는 강한 샘플 용매의 사용이 그림 2B에 나타난 프론팅 피크의 원인임을 보여줍니다. 이러한 문제를 방지하는 동시에 소수성이 가장 높은 분석 물질이 확실히 용해되도록 하기 위해, 아세토니트릴의 농도는 10%로 결정되었습니다. 10/90 v/v 아세토니트릴/물에 용해된 샘플 4µL를 주입하여 얻은 크로마토그램은 그림 2C에 나와 있습니다. 이제 예상대로 모든 피크의 높이가 2µL의 주입에 비해 2배 증가했으며, 피크의 대칭성 또한 양호합니다. 주입 부피를 최적화할 때는 항상 초기 이동상 조성에 대한 샘플 용매의 강도를 고려해야 합니다.