이전에 사용한 컬럼의 피크 모양 변화

이 시리즈를 통해 논의한 바와 같이, 피크 모양의 변화는 HPLC 분석에서 흔히 발생하는 문제입니다. 피크는 가우스 모양에 따라 대칭을 이루는 것이 이상적입니다 [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353–362]. 피크의 대칭성은 그림 1에 표시된 것처럼 USP 테일링 인자(T)의 계산을 통해 정량화할 수 있습니다. 테일링 인자가 1이면 완벽한 대칭성을 나타내며, 1보다 작은 값은 프론팅, 1보다 큰 값은 테일링이라고 합니다. 많은 분석법에서는 모든 피크의 테일링 인자가 지정된 범위 내에 있어야 합니다. 테일링 인자가 1에서 크게 벗어날 경우 서로 가까이 용리되는 피크의 분리능을 감소시켜 피크의 적분을 더 어렵게 만들 수 있습니다 [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021), pp. 353–362].

이전에 사용된 컬럼에서 기존의 분석법을 실행하도록 설정할 경우, 적합성 테스트를 수행하여 컬럼의 상태가 양호한지 확인해야 합니다. 이 테스트에서는 컬럼 및 시스템이 허용 가능한 압력, 머무름 시간, 피크 면적, 피크 너비, 피크 대칭성을 산출하는 능력을 평가해야 합니다. 이전에 컬럼으로부터 얻은 결과와 비교하여 이러한 반응이 크게 변화할 경우, 문제가 있을 가능성이 있습니다. 그림 2에 Waters 역상 QC 참조 물질(p/n: 186006363)을 사용한 예가 나와 있습니다. 7개의 화합물이 포함된 이 참조 물질은 기울기 분석법을 사용하여 분석되었습니다. 처음에(그림 2A), USP 테일링 인자는 0.90~1.27의 범위로 허용 가능한 수준입니다. 컬럼을 시스템에서 분리한 다음 나중에 다시 연결한 후 동일한 시험 분석법을 수행하여, 그림 2B에 표시된 크로마토그램을 생성했습니다. 머무름 시간, 피크 면적, 컬럼 압력은 초기 결과와 유사했지만, 7개 피크 모두에 대한 USP 테일링 인자는 1.32~1.65에 해당하여 더 높았습니다.

파트 1에서 논의한 바와 같이, HPLC 시스템, 이동상, 샘플, 컬럼 문제를 포함하여 피크의 대칭성에 변화를 유발하는 요소는 몇 가지가 존재합니다. [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385–420]. 앞서 논의한 바와 같이, 문제 해결을 위한 좋은 출발점은 크로마토그램을 주의 깊게 분석하여 피크 모양의 변화가 모든 피크에서 나타나는지 혹은 일부 피크에서 나타나는지 관찰하는 것입니다. 그림 2B와 같이 크로마토그램의 모든 피크가 유사한 피크 모양 변화를 보이는 경우, 이에 대한 원인으로는 컬럼에 빈 공간이 있거나, 컬럼에 샘플 매트릭스 성분이 축적되어 있거나, 컬럼과 HPLC 시스템의 연결 상태가 불량한 것 등을 들 수 있습니다. 이전에 컬럼을 사용할 때는 문제가 나타나지 않았으므로, 컬럼에 빈 공간이 있거나 샘플 매트릭스가 축적되었을 가능성은 작습니다. 따라서 가장 유력한 원인은 HPLC 시스템과의 연결 상태 불량입니다. 컬럼 연결부를 다시 장착한 후, 적합성 시험 분석법을 다시 수행했습니다. 그림 2C에서 볼 수 있듯이, USP 테일링 인자는 초기 값으로 복원되었습니다. 이로써, 부적절한 컬럼 연결로 인해 컬럼과 시스템에 연결되는 튜브 사이에 틈이 생겨 문제가 발생했음을 확인할 수 있습니다(그림 3 참조). 작은 틈으로도 피크 모양의 왜곡이 발생할 수 있습니다. 다양한 유형의 끝 피팅(Fitting)이 있는 컬럼을 여러 HPLC 시스템에 연결하는 방법에 대한 데모는 다음 URL의 동영상 시리즈 HPLC 컬럼을 Waters LC 시스템에 연결하는 방법을 참조해 주세요.