UPLC 입문자 가이드

성능 향상의 결과물

시스템 압력 문제 해결

이전 섹션에서는 더 작은 크로마토그래피 입자와 최소화된 시스템 띠 넓어짐의[기기와 컬럼 모두] 이점을 소개했습니다. UPLC 기술은 시스템 띠 넓어짐을 최소화하여 더 짧은 시간에 보다 효율적인 분리를 지원함으로써 더 나은 데이터 품질을 얻고 크로마토그래피 성능 향상을 촉진합니다. 그러나 작은 입자로 달성할 수 있는 성능을 결정하는 요인은 띠 넓어짐뿐만이 아닙니다. 기기에 대해 적용 가능한 압력 또한 중요한 역할을 합니다.

압력은 이동상이 펌프에서 주입기, 주입기에서 컬럼, 컬럼 자체, 컬럼 뒤에 추가된 튜브 및 검출기 셀로 이어지는 연결 튜브를 통과할 때 내재적으로 발생합니다. 시스템 압력 측정치는 이러한 모든 구성 요소[기기 및 컬럼]의 누적된 영향입니다. 유량이 증가함에 따라 연결 튜브를 흐르는 이동상에 의해 생성되는 압력은 증가하게 됩니다. 또한 튜브의 길이뿐 아니라 내경도 유량과 결합하여 압력 발생에 영향을 미칩니다. 기기 자체에서 생성된 압력을 총 시스템 압력[기기 + 컬럼]에서 감산하면 두 컬럼의 압력 차이를 이론적 예측값과 비교할 수 있습니다.

입자 크기가 작아질수록 역압은 입자 직경의 제곱에 반비례하는 속도로 증가합니다. 동시에, 최적의 이동상 속도[선속도]는 입자 직경이 감소함에 따라 증가합니다. 따라서 특정한 입자 크기에 대한 최상의 선속도에서의 압력은 입자 직경의 입방체에 반비례하는 속도로 증가합니다[그림 44].

그림 44: 일정한 컬럼 길이에 대한 최적 압력[∆Popt]과 입자 크기[dp] 사이의 관계. 입자 크기가 3분의 1로 감소하면 압력이 27배 증가합니다.

이는 크로마토그래피 분리능을 향상시키거나[입자 크기를 줄이면서 컬럼 길이를 일정하게 유지] 분리능을 유지하면서 분석 속도를 향상시키기 위해[L/d_p 비율을 일정하게 유지] 기존의 HPLC 기기 장치에서 더 작은 입자 컬럼을 활용하려고 할 때 상당히 제한적입니다. 기존 HPLC 기기의 압력 한계 [350–400 bar, 5000–6000 psi]로 인해, 더 작은 입자를 사용하면 컬럼 길이에 제한이 생기거나 차선책의 선속도[유량 속도]로 작동하는 경우가 종종 발생합니다.

일정한 컬럼 길이의 경우, 이론적으로 입자 크기가 5.0μm에서 1.7μm로 감소하면[입자 크기 3배 감소] 역압이 27배 증가할 것으로 예측됩니다. 이론적인 예측과 거의 일치하게, 5.0μm 컬럼에서 동일한 길이의 1.7μm 컬럼으로 전환될 때 시스템 압력은 22배 증가했습니다. 관측된 바와 같이 1.7μm 컬럼은 기존의 HPLC 기기의 상한 압력보다 훨씬 높게 작동합니다[그림 45].

입자 크기가 감소할 때 관측된 역압의 광범위한 증가는 sub 2µm 입자 컬럼[및 해당 LC 기기]이 ACQUITY UPLC 시스템이 출시될 때까지 상업적으로 성공하지 못한 주된 이유 중 하나입니다.

그림 45: 입자 크기와 최적 유량이 컬럼 압력[전체 시스템 압력에서 차감된 압력]에 미치는 영향. 일정한 컬럼 길이. 2.1 x 50mm 컬럼, 유량 = 0.6mL/분[1.7µm] 및 0.2mL/분[5µm].

분리 목표가 분석 시간 감소에 따른 분리능 유지일 경우[L/d_p 비율을 일정하게 유지], 압력의 증가는 입자 크기를 줄이면서 컬럼 길이를 일정하게 유지하는 것보다 훨씬 작습니다. 압력의 변화는 컬럼 길이에 비례적인 감소로 인해 입자 크기[입자 크기의 입방체가 아님]의 제곱에 반비례합니다.

그림 46: 다른 컬럼 길이에 대한 최적 압력[∆Popt]과 입자 크기[dp] 사이의 관계. 입자 크기와 컬럼 길이가 3분의 1로 감소하면 압력이 9배증가합니다].

해당 예시에서는 컬럼 길이와 입자 크기가 모두 3배 감소합니다[그림 47]. 이는 역압이 9배 증가할 것으로 예상됨을 의미합니다. 관측된 값은 이론적 예측값과 거의 일치합니다. L/d_p를 일정하게 유지할 경우 5.0μm, 150mm 길이의 컬럼에서 1.7μm, 50mm 길이의 컬럼으로 전환될 때 역압이 11배 증가하는 것이 관측됩니다.

그림 47. 입자 크기, 컬럼 길이 및 최적 유량이 컬럼 압력[전체 시스템 압력에서 차감된 압력]에 미치는 영향. 일정한 L/d_p비율. 분석 시간의 상당한 차이에 유의하십시오[UPLC 분리능은 7]

최적 유량으로 실행하면 작은 입자로 인해 발생하는 압력이 기존 HPLC 시스템의 압력 한계를 초과하게 됩니다. ACQUITY UPLC 시스템[상한 압력 1030bar, 15,000psi]은 이러한 압력을 수용하도록 설계되어 sub 2µm 입자가 최적 유량에서 성공적으로 실행될 수 있도록 합니다.

상승된 온도

작은 입자로 인해 발생하는 높은 압력을 보완하기 위한 한 가지 접근법은 컬럼 온도를 올리는 것입니다. 컬럼 온도가 증가함에 따라 이동상의 점도가 감소하여 [유량이 일정하게 유지되는 경우] 역압이 감소합니다. 다만, 분석물 분자가 고정상 공극을 안팎으로 이동[확산]하는 속도 또한 증가하여 성능을 유지하기 위해서는 유량을 증가시킬 필요가 있습니다.

컬럼 온도를 30°C에서 90°C로 올릴 경우, 효율성을 유지하기 위해 유량을 늘려야 합니다[그림 48]. 크로마토그래피 이론과 일치하는 두 온도에서 가장 높은 플레이트 수를 비교할 경우 효율성 증가는 관찰되지 않습니다.

그림 48: 컬럼 온도가 효율성에 미치는 영향. ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 x 100mm, 1.7µm 컬럼에서 amylbenzene에 대한 등용매(Isocratic) 머무름.

플레이트 수를 시스템 압력에 대해 플롯할 경우 더 흥미로운 비교가 가능합니다[그림 49]. 이러한 방식으로 데이터를 플롯하면, 분리 온도와는 무관하게 거의 동일한 시스템 압력에서 최대 컬럼 효율이 달성된다는 것을 명확하게 알 수 있습니다. 이는 상승된 온도가 작은 입자 사용과 관련된 압력을 우회하는 데 사용될 수 없음을 의미합니다. 즉, 기존의 HPLC 기기는 매우 작은 입자의 효율적인 사용에 적합하지 않습니다.