UPLC 입문자 가이드

샘플 혼합물은 샘플 바이알에서 운동 유체 흐름[이동상]으로 전달됩니다. 그런 다음 샘플은 고압 펌프에 의해 이동상을 따라 크로마토그래피 컬럼의 헤드로 운반됩니다. 이동상과 주입된 샘플 혼합물은 컬럼으로 들어가 입자 베드를 통과하고 빠져나와 분리된 혼합물을 검출기로 전달합니다[그림 3].

먼저 샘플 띠를 개별 분석물 띠[흐름 방향은 녹색 화살표로 표시됨]로 분리하는 방법을 살펴보겠습니다. 그림 4A는 샘플이 컬럼에 들어가 띠를 형성하기 시작하는 영점 시간[주입 순간]의 컬럼을 나타냅니다. 여기에 있는 샘플은 노란색, 빨간색 및 파란색 염료가 혼합된 것으로, 컬럼의 주입구에는 단일 검은색 띠로 표시됩니다.

몇 분이 지난 후 이동상이 충전제 입자를 통해 지속적으로 흐르는 동안 개별 염료가 각기 다른 속도로 이동해 별도의 띠를 형성했음을 확인할 수 있습니다[그림 4B]. 이는 각 염료나 분석물을 끌어들이기 위한 이동상과 고정상 간의 경합이 있기 때문입니다. 노란색 염료 띠가 가장 빠르게 움직이며 곧 컬럼에서 용리됩니다. 노란색 염료는 다른 염료보다 이동상에 대한 친화력[흡입력]이 높습니다. 따라서, 이는 이동상에 가까운 더 빠른 속도로 이동합니다. 파란색 염료 띠는 이동상보다 충전제에 대한 친화력이 더 높습니다. 입자에 더 강하게 끌리기 때문에 이동 속도가 상당히 느려집니다. 즉, 이 샘플 혼합물에서 가장 오래 머무르는 화합물입니다. 빨간색 염료 띠는 이동상에 대해 중간의 끌림을 가지므로 컬럼에서 중간 속도로 이동합니다. 각 염료 띠는 다른 속도로 움직이기 때문에 크로마토그래피 원리에 따라 이 혼합물을 분리할 수 있습니다.

크로마토그래피 띠가 피크를 형성하는 방법

각각의 특정 분석물 띠는 많은 분석물 분자로 구성되어 있습니다. 띠의 중심은 분석물 분자의 농도가 가장 높은 반면 띠의 선단 및 후단 가장자리는 이동상의 간섭을 받으면서 농도가 점차 낮아집니다[그림 5].

분리된 염료 띠가 컬럼을 나가면 즉시 검출기로 전달됩니다. 이동상의 백그라운드에 대비시켜 분리된 각 화합물 띠를 확인[검출]합니다[그림 6 참조]. 적절한 검출기[UV, ELS, 형광, 질량 등]는화합물의 존재를 감지하고 해당 전기 신호를 피크로 기록하는 컴퓨터 데이터 스테이션으로 보내는 기능을 가지고 있습니다. 검출기는 띠 내 특정 분석물 분자의 농도의 변화에 반응하며, 여기서 검출기는 띠의 중심[분석물 분자의 가장 높은 모집단]을 피크의 정점으로 해석합니다.

크로마토그램 개요

크로마토그램은 HPLC 시스템에서 화학적으로[크로마토그래피 원리에 따라] 이루어지는 분리를 나타냅니다. 베이스라인에서 상승하는 일련의 피크가 시간 축을 따라 그려집니다. 각 피크는 다른 화합물에 대한 검출기 반응을 나타냅니다. 크로마토그램은 컴퓨터 데이터 스테이션에서 그래프로 그려집니다[그림 6 참조]. 노란색 띠는 검출기 플로우 셀을 완전히 통과했고, 생성된 전기 신호는 컴퓨터 데이터 스테이션으로 전송되었습니다. 생성된 크로마토그램이 화면에 나타나기 시작했습니다. 크로마토그램은 샘플이 처음 주입될 때 시작되고 화면 하단 근처에 설정된 직선으로 시작됩니다. 이것을 베이스라인이라고 합니다. 시간이 지남에 따라 여기에 플로우 셀을 통과하는 순수한 이동상이 나타납니다. 노란색 분석물 띠가 플로우 셀을 통과하면 시그널[분석물 분자의 농도에 따라 달라짐]이 컴퓨터로 전송됩니다. 샘플 띠의 노란색 염료 농도에 비례하여 위쪽으로 향했다가 아래로 내려오는 곡선이 형성됩니다. 이렇게 크로마토그램에 피크가 생성됩니다. 노란색 띠가 검출기 셀을 완전히 통과하면 신호 레벨이 베이스라인으로 돌아갑니다. 이제 플로우 셀에는 다시 한 번 순수한 이동상만 들어 있게 됩니다. 노란색 띠가 가장 빠르게 이동하여 컬럼에서 먼저 용리되므로 이 피크가 가장 먼저 그려집니다. 잠시 후 빨간색 띠가 플로우 셀에 도달합니다. 빨간색 띠가 먼저 셀에 들어감에 따라 베이스라인에서 신호가 상승하고 빨간색 띠를 나타내는 피크가 그려지기 시작합니다. 이 다이어그램에서 빨간색 띠는 플로우 셀을 완전히 통과하지 않았습니다. 이 순간에 프로세스를 멈출 경우 다이어그램은 빨간색 띠와 빨간색 피크가 어떤 모습인지를 보여줍니다. 대부분의 빨간색 띠가 셀을 통과했기 때문에 실선과 같이 대부분의 피크가 그려졌습니다. 크로마토그래피 프로세스를 계속 진행한다면, 빨간색 띠는 플로우 셀을 완전히 통과하고 빨간색 피크는 완성[점선]될 것입니다. 가장 머무름 특성이 강한 파란색 띠는 가장 느리게 이동해 빨간색 띠 다음으로 용리됩니다. 점선은 실행을 끝까지 계속했다면 완성되었을 크로마토그램의 모습을 보여줍니다. 흥미롭게도, 파란색 분석물 띠의 너비는 컬럼에서 가장 좁지만 컬럼에서 용리됨에 따라 가장 넓어지기 때문에 파란색 피크의 너비가 가장 넓습니다. 이는 크로마토그래피 충전재 베드를 통해 더 천천히 이동하고 완전히 용리되는 데 더 많은 시간[및 이동상의 양]이 필요하기 때문입니다. 이동상은 일정한 속도로 계속 흐르기 때문에 이것은 파란색 띠가 넓어지고 옅어짐을 의미합니다. 검출기는 띠의 농도에 비례하여 반응하므로 파란색 피크는 높이가 낮고 너비가 넓습니다.

띠 넓어짐

샘플/분석물 띠가 검출기에 도달하기 전에 크로마토그래피 시스템의 여러 구성 요소를 통과하여 크로마토그래피 띠가 변형되고 넓어질 것입니다[그림 7]. 이 현상을 띠 넓어짐이라고 합니다. 분석물 띠가 넓어질수록 생성된 크로마토그래피 피크 너비는 넓어집니다. 띠가 넓어지면 감도 및 분리능 상실을 동반한 피크 높이 감소를 초래하는 희석 효과가 발생합니다. 반대로 띠 넓어짐이 최소화되면 크로마토그래피 띠가 좁아져 효율성이 높아집니다. 이렇게 크고 좁은 크로마토그래피 피크는 검출기에 의해 더 쉽게 검출될 수 있습니다. 농도가 높은 분석물 띠로 인해 더 높은 감도와 분리능을 확인할 수 있습니다. 따라서 전체적인 크로마토그래피 성능을 향상시키기 위해서는 이러한 영향을 줄이고 제어하려는 노력에 있어 띠 넓어짐에 영향을 미치는 요인을 파악하는 것이 중요합니다.

크로마토그래피 시스템 내에서 컬럼과 컬럼 외[컬럼 이외의 모든 것]의 영향은 모두 띠 넓어짐의 원인이 됩니다. 컬럼 외 소스에는 주입 부피, 샘플 주입기와 컬럼 사이 기기의 유로, 컬럼 출구에서 검출기[플로우 셀 포함]까지의 모든 연결부가 포함됩니다. 띠 넓어짐의 컬럼 소스에는 충전제의 입자 크기, 컬럼 내의 재료가 얼마나 잘 충전되어 있는지, 이동상의 속도와 관련된 확산 특성, 분석물 크기 및 기하학적 구조가 포함됩니다. 이러한 원인 각각에 대한 분산의 합계(σ2)는 피크 너비에 영향을 줍니다[그림 8].

액체 크로마토그래피에서 성능을 크게 향상시키기 위해서는 컬럼 외 그리고 컬럼 띠 넓어짐의 영향을 줄여야만 합니다. ACQUITY UPLC 시스템은 효율성과 감도의 유의미한 향상을 위해 두 가지 형태의 띠 넓어짐 축소 개념에 기반을 두고 있습니다[그림 9].

컬럼 외[기기] 띠 넓어짐 문제 해결

크로마토그래피 성능의 의미 있는 향상을 위해, 분리 컬럼의 이론적 성능을 달성할 수 있도록 유동 경로의 분산을 최소화하면서 작은 입자[sub 2µm] 충전제로 생성된 압력을 수용할 수 있는 LC 기기를 설계하기 위해 상당한 엔지니어링 노력이 투입되었습니다. 일상적인 실험실에서 사용할 수 있는 신뢰할 수 있고 견고하며 정밀한 분석 도구 또한 중요합니다. 기기 설계의 중요성을 입증하기 위해서는 시스템 분산[기기 + 컬럼 띠 넓어짐]이 크로마토그래피 결과에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해할 필요가 있습니다.

플레이트 수[N] 또는 효율성의 측정은 피크 분산을 고려합니다. 피크 너비는 검출기를 통과할 때 분석물 띠의 너비와 직접적인 관련이 있으며, 피크의 정점은 해당 띠 안에서 분석물 분자 농도가 가장 높은 지점입니다. 이 측정은 등용매(isocratic) 조건에서 수행됩니다.

플레이트 수 방정식은 그림 10과 같이 도출할 수 있는데, 여기서 [Vn]은 피크의 용리 부피, [w]는 피크 너비, [a]는 피크 너비가 측정된 지점의 피크 높이를 기준으로 결정되는 상수입니다. 피크 너비를 측정하는 각 분석법은 피크가 완벽하게 대칭인 경우 동일한 플레이트 수를 산출합니다. 피크에 프론팅 현상 또는 테일링 현상이 나타나면 이러한 측정 분석법은 다른 결과를 산출합니다.

플레이트 수가 컬럼 자체에 의해 달성되는 성능만을 의미한다는 것은 일반적인 오해입니다. 컬럼과 기기에서 모두 띠 넓어짐은 플레이트 수가 결정되는 피크 너비에도 영향을 미칩니다. 띠 넓어짐에 대한 기기 자체의 영향을 입증하기 위해 단일 HPLC 컬럼을 두 개의 다른 기기인 표준 HPLC[띠 넓어짐 = 7.2µL]와 ACQUITY UPLC 시스템[띠 넓어짐 = 2.8µL]에 대해 실행했습니다. 두 시스템에서 동일한 컬럼이 실행되므로 컬럼의 띠 넓어짐 영향은 일정하게 유지됩니다. ACQUITY UPLC 시스템에서 관찰된 효율성의 증가는 띠 넓어짐이 적은 기기가 어떻게 더 좁은 피크 너비를 생성하여 더 높은 플레이트 수를 발생시키는지를 보여줍니다[그림 11].

튜브 길이와 직경의 영향

샘플 띠가 유체 흐름에 전달된 후 컬럼으로 이동합니다. ACQUITY UPLC Sample Manager는 띠 넓어짐을 최소화하기 위해 주입기와 컬럼 주입구 사이의 거리를 최소화하도록 설계되었습니다. 이 컬럼은 샘플 띠를 개별 분석물 띠로 분리합니다. 그런 다음 크로마토그래피로 분리된 분석물 띠가 컬럼에서 검출기로 전달됩니다. 처음에는 컬럼 outlet 및 검출기 inlet을 연결하는 튜브 내경[ID]의 중요성을 고려하지 않을 수 있지만 내경은 기기 띠 넓어짐에 큰 영향을 미칠 수 있습니다[그림 12].

예상할 수 있듯이 튜브 내경이 줄면 띠 넓어짐이 완화됩니다. 농도가 높은 분석물 띠를 내경이 큰 튜브에 흐르게 함으로써 띠의 농도가 훨씬 낮아져 피크가 넓어지고 왜곡되며 감도는 감소합니다. 또한 튜브 벽을 따라 마찰이 발생하면 튜브 벽과 접촉하는 분석물 분자가 튜브 중앙의 분자보다 느리게 이동하여 띠 프로필이 왜곡됩니다. 튜브 내경이 감소하면 분석물 띠의 중심과 외부 가장자리 사이의 거리가 줄어 띠의 변형을 줄여줍니다. 과도한 길이는 샘플 띠를 왜곡시킬 수 있으므로 튜브 길이를 최소화하는 것 또한 중요합니다.

검출기 설정이 컬럼 외 띠 넓어짐에 미치는 영향

유체 기반의 띠 넓어짐에 대한 기기의 영향 외에 수집 속도 및 필터 상수와 관련된 디지털 검출기 설정도 크로마토그래피 결과에 영향을 줍니다. 피크 너비는 보통 매우 좁고[1-2초 너비] 분석 시간이 매우 짧을 수 있기 때문에 이는 UPLC 응용 분야에서 특히 중요합니다. 검출기의 수집 속도를 설정할 때 피크를 적절하게 나타내기 위해 피크 간에 충분한 데이터 포인트를 획득할 수 있도록 선택해야 합니다. 검출기 속도를 너무 높게 설정하면 시그널 대 잡음 비율에 부정적인 영향을 미쳐 원하는 분석물의 시그널 높이를 증가시키지 못하고 바탕선 잡음이 증가합니다. 반대로 검출기 수집 속도를 너무 느리게 설정하면 피크 간에 부적절한 데이터 포인트가 발생하여 관측된 크로마토그래피 효율성이 저하되고 정량화 재현 능력 또한 감소합니다. 또한 시간 상수[디지털 필터]는 시그널 대 잡음을 최적화하기 위해 데이터 포인트를 매끄럽게 만드는 데 사용되며 수집 속도와 함께 사용하거나 수집 속도와는 독립적으로 사용할 수 있습니다.

분석물 띠의 너비가 좁아짐에 따라 검출기 설정의 중요성이 커집니다. 특정 속도의 피크를 디지털로 생성할 수 있을 만큼 충분히 빠른 수집 속도가 필요하며, 가까운 용리 피크가 존재하는 경우 UPLC 컬럼에서 확인된 고분리능 분리를 적절히 렌더링할 수 있어야 합니다.

피크가 시간에 따라 분산된 느린 유량에서는 이러한 설정이 허용됩니다. 그러나 피크가 좁아지고 분석이 더 빨라질수록[UPLC 분리처럼] 수집 속도와 시간 상수의 적절한 설정이 유지되어야 합니다[그림 13]. UPLC 기술을 '실제' 응용 분야에 활용할 경우, 가장 좁은 피크의 피크 모양을 정확하게 포집하는 검출기 데이터 수집 속도[Hz]를 선택한 다음 최적의 시그널 대 잡음 및 분리능을 제공하는 필터 시간 상수[초]를 적용하는 것이 바람직합니다.